【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種基因檢測，特別是涉及一種工程化crrna及其在制備檢測病原體或與病原體相關的耐藥基因試劑中的應用。
技術介紹
1、呼吸系統疾病嚴重危害人類健康，其中以細菌、病毒為代表的病原微生物感染是引發呼吸系統疾病的主要因素。呼吸道傳染病具有發病率高、傳播快、極易引起嚴重的公共安全事件，我們需要更加快速、精準的檢測方法來實現早發現、早隔離、早治療的目標。相比較于傳統病原體的鑒定方法，核酸檢測技術是早期診斷的利器。盡管qpcr作為核酸檢測金標準已經廣泛應用于一線檢測中，但是基于變溫擴增的檢測技術需昂貴的設備，且需要標準化的實驗室和專業技術人員進行操作，反應時間長，難以滿足即時檢測要求，對于病原體含量極低的情況無法實現早期監測。如何更加快速、簡便、準確、低成本的檢測，是病原體核酸檢測未來的發展方向。
2、現有的一些核酸快速檢測方法有lamp(環介導等溫擴增)以及rpa-exo探針法(重組酶聚合酶擴增-探針法)等。這類方法在一些特殊恒溫核酸擴增酶介導下，擺脫了對變溫設備的依賴，靶標核酸可以在固定溫度進行核酸擴增與檢測。基于lamp或raa的核酸恒溫擴增檢測，雖然擺脫了熱循環設備的限制，但是其高速擴增和高靈敏度帶來了假陽性的可能。
3、crispr/cas系統是一種新興核酸檢測工具，并顯示出下一代分子診斷方法的巨大潛力。crispr序列是一個特殊的dna重復序列，包含有高度保守的長度約為21-48bp的重復序列(repeats)和26-72bp的間隔序列(spacer)。重復序列被不同的間隔序列隔開，cris
4、目前已鑒定出很多種cas蛋白能在sgrna引導下對靶位點進行切割。cas12a屬于該家族中的一種，能在sgrna引導下對靶基因進行特定切割，同時被激活的cas12a可發揮非特異性剪切酶活性，對所遇到的單鏈dna(ssdna)進行非特異性剪切。利用cas12a可被靶向激活的特性，經過特異性地設計，可以用于靶基因的特異性檢測。
5、基于crispr/cas系統的恒溫檢測則在恒溫擴增方法的基礎上引入了高度精確的crispr系統，極大提高了檢測方法的精確度與靈敏度。
6、當前，基于crispr的恒溫速檢測技術主要分為兩大類，即2020年諾貝爾化學獎得主jennifer?doudna開發的依賴于cas12a的稱為detectr的核酸恒溫檢測技術，以及張鋒開發的依賴于cas13a的稱為sherlock的核酸恒溫檢測技術。其原理都是通過恒溫擴增方法如lamp、rpa等對目的片段進行擴增富集，擴增后的目的片段會被cas蛋白通過一段sgrna的引導靶向識別，激活cas蛋白成為一個dna切割機(cas12a)或者rna切割機(cas13a)，將附近所有的單鏈dna(cas12a)或者單鏈rna(cas13a)進行切割。基于該原理，將單鏈dna制備成熒光淬滅探針，通過監測熒光信號的釋放實現對目的序列的特異性檢測。
7、依賴于cas12a的核酸恒溫檢測技術因為在crispr環節不需要進行逆轉錄，因此在成本和速度上都更有優勢，但檢測靈敏度上需進一步提高。
技術實現思路
1、鑒于以上所述現有技術的缺點，本專利技術的目的在于提供一種工程化crrna及其在制備檢測病原體或與病原體相關的耐藥基因試劑中的應用，用于解決現有技術中的問題。
2、為實現上述目的及其他相關目的，本專利技術首先提供一種工程化crrna，所述工程化crrna包括crrna骨架和增敏序列，所述crrna骨架包括固有序列和導向序列，所述固有序列包括莖環結構，所述導向序列用于與靶基因結合，所述增敏序列與導向序列的3’末端連接，所述增敏序列為1～15nt、不含gc堿基的dna片段。
3、本專利技術還提供一種crispr/cas系統，所述crispr/cas系統包括上述工程化crrna。
4、本專利技術還提供一種上述工程化crrna、或上述crispr/cas系統在制備檢測病原體或與病原體相關的耐藥基因試劑中的應用。
5、如上所述，本專利技術的一種工程化crrna及其在制備檢測病原體或與病原體相關的耐藥基因試劑中的應用，具有以下有益效果：通過在crrna的3’末端添加7nt單鏈dna的增敏序列，提高了向導序列與靶序列結合幾率，從而顯著提升了crisp/cas檢測系統靈敏度，對靶序列的檢測下限可達1拷貝/反應。
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1.一種工程化crRNA，其特征在于，所述工程化crRNA包括crRNA骨架和增敏序列，所述crRNA骨架包括固有序列和導向序列，所述固有序列包括莖環結構，所述導向序列用于與靶基因結合，所述增敏序列與導向序列的3’末端連接，所述增敏序列為1～15nt、不含GC堿基的DNA片段。
2.根據權利要求1所述的工程化crRNA，其特征在于，所述DNA增敏序列的長度為3～11nt。
3.根據權利要求1所述的工程化crRNA，其特征在于，所述固有序列如SEQ?ID?NO.112所示。
4.根據權利要求1所述的工程化crRNA，其特征在于，所述靶基因選自病原體中的致病基因或與病原體有關的耐藥基因。
5.根據權利要求4所述的工程化crRNA，所述病原體選自甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎鏈球菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、新型冠狀病毒、腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、流感嗜血桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、大腸埃希氏菌、卡他莫拉菌、嗜肺軍團菌、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎衣原體、耶氏孢子菌中的一種或多種。
7.一種CRISPR/Cas系統，其特征在于，所述CRISPR/Cas系統包括權利要求1～6中任一所述的工程化crRNA。
8.根據權利要求7所述的CRISPR/Cas系統，其特征在于，所述CRISPR/Cas系統包括緩沖液、Cas蛋白酶或報告探針中的一種或多種。
9.根據權利要求8所述的CRISPR/Cas系統，其特征在于，所述Cas蛋白酶為Cas12a蛋白酶。
10.根據權利要求1～6任一所述的工程化crRNA、或權利要求7～9任一所述的CRISPR/Cas系統在制備檢測病原體或與病原體相關的耐藥基因試劑中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種工程化crrna，其特征在于，所述工程化crrna包括crrna骨架和增敏序列，所述crrna骨架包括固有序列和導向序列，所述固有序列包括莖環結構，所述導向序列用于與靶基因結合，所述增敏序列與導向序列的3’末端連接，所述增敏序列為1～15nt、不含gc堿基的dna片段。
2.根據權利要求1所述的工程化crrna，其特征在于，所述dna增敏序列的長度為3～11nt。
3.根據權利要求1所述的工程化crrna，其特征在于，所述固有序列如seq?id?no.112所示。
4.根據權利要求1所述的工程化crrna，其特征在于，所述靶基因選自病原體中的致病基因或與病原體有關的耐藥基因。
5.根據權利要求4所述的工程化crrna，所述病原體選自甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎鏈球菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、新型冠狀病毒、腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、流感嗜血桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、大腸埃...
【專利技術屬性】
技術研發人員：紀元，宋元林，李華茵，江崢增，王琴，侯東妮，李倬哲，
申請(專利權)人：復旦大學附屬中山醫院，
類型：發明
國別省市：
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