【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及由各種種類的細胞制作細胞片的方法。特別是涉及細胞片的制作方法，該細胞片是由包含視網膜色素上皮細胞、間充質干細胞、成纖維細胞、ips細胞誘導多能干細胞及ips來源分化細胞、es細胞及es細胞來源最終細胞的各式各樣的細胞制作的。
技術介紹
1、為了治療各式各樣的疾病，已報道有細胞培養片的移植療法。所謂細胞培養片的移植療法是如下技術：將由人體采集或人工制作的干細胞在孔板(培養皿)中培養，將所獲得的片狀的培養細胞配置于由外傷或疾病等所造成的組織的缺損部，將缺損部修復。
2、已嘗試有如下方法：以接近在生物體內的形態的細胞片的狀態，將視網膜色素上皮細胞移植來治療視網膜變性疾病。例如，老年黃斑變性的治療，將視網膜色素上皮細胞或視網膜色素上皮移植到視網膜下的缺損部位的方法是有效的治療方法(專利文獻1：日本特表平9-501303號公報，專利文獻2：日本特開2008-173333號公報)。雖然已實行了將由老年黃斑變性患者的視網膜組織切出的視網膜色素上皮細胞(制成伴隨脈絡膜的層)而成的細胞片，移植至受到損傷的黃斑部分這樣的自體組織移植，但是該源自患者組織的細胞片仍有下述問題：除了移植手術之外還增加了患者視網膜的切除手術所造成的侵入性風險，并發癥的發病率高，并且移植后確認黃斑功能的改善、穩定維持的效果的比例低。
3、作為不依賴患者視網膜的采集而利用在生物體外培養的視網膜色素上皮細胞和虹膜色素上皮細胞等色素上皮細胞的方法，已知有將在人工膜或羊膜上培養色素上皮細胞而制成的細胞片用于移植的方法。但是，人工膜的組成、性質、
4、然而，期望一種更簡便且效率良好的細胞片的制作方法。此外，所制成的細胞片要自培養皿剝離而用于移植，但是剝離后的細胞片會自支撐體(平面基材)分離，因此會有在醫療現場實行移植之前形狀容易變化而處理不易這樣的問題。
5、此外，以對移植后的色素上皮供給營養和氧氣為目的，已報道有一種細胞片的制造方法，該細胞片包含色素上皮細胞層及血管生成細胞層(專利文獻4：wo2014/030749)。
6、間充質干細胞(msc：mesenchymal?stem?cell)是具有多分化能力及自我復制能力的干細胞，具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞這樣的源自中胚層的細胞的能力，除此之外，還被報道有也能分化為源自外胚層的神經細胞、神經膠質細胞、源自內胚層的肝細胞的能力。msc已知還具有歸巢效應、旁分泌效應及細胞粘附相互作用。認為msc基于這些作用，發揮目標組織、細胞的修復/再生能力以及抗炎癥等免疫控制能力，其結果顯示了對各式各樣疾病的治療效果。
7、已報道有使用msc的細胞移植療法，例如已報道有一種治療腎臟疾病的嘗試，其通過將包含msc的細胞片組合物應用于腎臟(專利文獻5：日本特開2017-132744)。
8、雖然已報道有使用了各式各樣的細胞的細胞片的制作方法，但是尚未出現能夠應用于包含msc或皮膚組織的細胞即成纖維細胞的各種種類的細胞的細胞片的制作方法，期望確立一種能夠應用于范圍廣泛的細胞種類的細胞片的制作方法。
9、現有技術文獻
10、專利文獻
11、專利文獻1：日本特表平9-501303號公報
12、專利文獻2：日本特開2008-173333號公報
13、專利文獻3：wo2011/142364
14、專利文獻4：wo2014/030749
15、專利文獻5：日本特開2017-132744號公報
技術實現思路
1、專利技術要解決的問題
2、本專利技術的目的在于提供一種細胞片的制作方法，其為簡便的細胞片的制作方法，并且通過該方法所制成的細胞片容易處理。本專利技術的目的還在于提供一種簡便的細胞片的制作方法，其能夠應用于各式各樣的細胞。
3、用于解決問題的方案
4、專利技術人致力于研究一種細胞片的制作方法，其為簡便的細胞片的制作方法，并且通過該方法所制成的細胞片容易處理，結果發現可利用底面具有多孔性膜的細胞培養容器來培養細胞，進而完成本專利技術。
5、本專利技術包括以下方案。
6、[1]一種細胞片的制作方法，其包括以下工序：
7、工序(1)，制備一種或多種的源自哺乳動物的細胞；
8、工序(2)，將制備的細胞播種于底面具有多孔性膜的第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；及
9、工序(3)，將前述第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中，培養細胞，在前述多孔性膜上制作細胞片。
10、[2]如上述[1]所述的方法，其中，前述第一細胞培養容器中的培養液或前述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者為包含血清和/或rho激酶(rock)抑制劑的培養液。
11、[3]如上述[1]或[2]所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或干細胞。
12、[4]如上述[3]所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳動物的細胞是選自由色素上皮細胞(例如虹膜色素上皮細胞、視網膜色素上皮細胞)、成纖維細胞及間充質干細胞所組成的組中的細胞。
13、[5]如上述[1]～[4]中任一項所述的方法，其中，在工序(2)中，以5000細胞數/mm2(優選為10000細胞數/mm2)以上將細胞播種于底面上。
14、[6]如上述[1]～[5]中任一項所述的方法，其中，在進行培養所獲得的細胞片中，在細胞的與前述多孔性膜接觸一側的相反側形成有包含細胞外基質的膜。
15、[7]如上述[6]所述的方法，其中，進行培養所獲得的細胞片進一步在細胞之間形成有緊密連接(tight?junction)。
16、[8]如上述[6]或[7]所述的方法，其進一步包括以下的工序(4)：
17、工序(4)，確認在細胞的與前述多孔性膜接觸一側的相反側形成有包含細胞外基質的膜。
18、[9]如上述[1]～[8]中任一項所述的方法，其進一步包括以下的工序(5)：
19、工序(5)，確認由工序(3)所獲得的培養細胞中有無分化標記物的表達。
20、前述分子標記物如下：當前述源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞等或虹膜本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種細胞片的制作方法，其包括以下工序：
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述第一細胞培養容器中的培養液或所述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者為包含血清和/或Rho激酶(ROCK)抑制劑的培養液。
3.如權利要求1所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或干細胞。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述源自哺乳動物的細胞是選自由色素上皮細胞、成纖維細胞及間充質干細胞所組成的組中的細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其中，在工序(2)中，以5000細胞數/mm2以上將細胞播種于底面上。
6.如權利要求1～5中任一項所述的方法，其中，在進行培養所獲得的細胞片中，在細胞的與所述多孔性膜接觸一側的相反側形成有包含細胞外基質的膜。
7.如權利要求6所述的方法，其中，進行培養所獲得的細胞片進一步在細胞之間形成有緊密連接。
8.如權利要求6所述的方法，其進一步包括以下的工序(4)：
9.如權利要求1～5中任一項所述的方法，其進一步包括以下的工序(5
10.如權利要求1～5中任一項所述的方法，其進一步包括以下的工序(5’)：
11.如權利要求1～4中任一項所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞、虹膜色素上皮細胞、間充質干細胞或成纖維細胞，并且，在工序(2)中，以5000細胞數/mm2～40000細胞數/mm2將細胞播種于底面上。
12.一種細胞片，其是由權利要求1～5中任一項所述的方法所制成的。
13.一種疾病治療用移植材料，其包含由權利要求1～5中任一項所述的方法所制成的細胞片。
14.一種包含細胞外基質的膜的制作方法，其包括如下工序：將形成于細胞片的包含細胞外基質的膜進行分離，該細胞片是由權利要求1～5中任一項所述的方法所制成的。
15.一種細胞片，其是配置于多孔性膜上的源自哺乳動物的細胞的細胞片，在該細胞片中，在細胞之間存在有細胞外基質，且在與所述多孔性膜接觸一側的相反側形成有包含細胞外基質的膜。
16.如權利要求15所述的細胞片，其中，所述細胞片進一步在細胞之間形成有緊密連接。
17.如權利要求15所述的細胞片，其中，所述細胞片通過如下方式獲得：將1種或多種的源自哺乳動物的細胞播種于第一細胞培養容器的底面的多孔性膜上，將該第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中進行培養。
18.如權利要求17所述的細胞片，其中，所述第一細胞培養容器中的培養液或所述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者為包含血清和/或Rho激酶(ROCK)抑制劑的培養液。
19.如權利要求17或18所述的細胞片，其中，所述源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或干細胞。
20.如權利要求19所述的細胞片，其中，所述源自哺乳動物的細胞是選自由色素上皮細胞、成纖維細胞及間充質干細胞所組成的組中的細胞。
21.如權利要求19所述的細胞片，其中，所述源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞。
22.如權利要求19所述的細胞片，其中，所述細胞片中所包含的細胞表達選自由下述物質組成的組中的至少一種分子標記物：卵黃狀黃斑病蛋白-1、RPE-65、廣譜細胞角蛋白及細胞角蛋白中的任一種亞型、閉合蛋白、ZO-1、彈性蛋白、肌動蛋白、1型膠原蛋白、2型膠原蛋白及4型膠原蛋白。
23.如權利要求19所述的細胞片，其中，所述細胞片中所包含的細胞分泌有可溶性Flt-1(VEGF受體1)和/或TIMP-3。
24.一種多層化細胞片的制造方法，其包括下述工序(1)～(4)：
25.一種多層細胞片，其由權利要求24所述的方法制造而成。
26.一種多層細胞片，其配置于多孔性膜上，在多層細胞片所包含的各細胞片中，在細胞之間存在有細胞外基質，且在與所述多孔性膜接觸一側的相反側形成有包含細胞外基質的膜。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種細胞片的制作方法，其包括以下工序：
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述第一細胞培養容器中的培養液或所述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者為包含血清和/或rho激酶(rock)抑制劑的培養液。
3.如權利要求1所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或干細胞。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述源自哺乳動物的細胞是選自由色素上皮細胞、成纖維細胞及間充質干細胞所組成的組中的細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其中，在工序(2)中，以5000細胞數/mm2以上將細胞播種于底面上。
6.如權利要求1～5中任一項所述的方法，其中，在進行培養所獲得的細胞片中，在細胞的與所述多孔性膜接觸一側的相反側形成有包含細胞外基質的膜。
7.如權利要求6所述的方法，其中，進行培養所獲得的細胞片進一步在細胞之間形成有緊密連接。
8.如權利要求6所述的方法，其進一步包括以下的工序(4)：
9.如權利要求1～5中任一項所述的方法，其進一步包括以下的工序(5)：
10.如權利要求1～5中任一項所述的方法，其進一步包括以下的工序(5’)：
11.如權利要求1～4中任一項所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞、虹膜色素上皮細胞、間充質干細胞或成纖維細胞，并且，在工序(2)中，以5000細胞數/mm2～40000細胞數/mm2將細胞播種于底面上。
12.一種細胞片，其是由權利要求1～5中任一項所述的方法所制成的。
13.一種疾病治療用移植材料，其包含由權利要求1～5中任一項所述的方法所制成的細胞片。
14.一種包含細胞外基質的膜的制作方法，其包括如下工序：將形成于細胞片的包含細胞外基質的膜進行分離，該細胞片是由權利要求1～5中任一項所述的方法所制成的。
15.一種細胞片，其是配置于多孔性膜上的源自...
【專利技術屬性】
技術研發人員：草野仁，宮內英征，酒井秀人，柳川聰秀，岡崎道貴子，田面喜之，
申請(專利權)人：生物制藥株式會社，
類型：發明
國別省市：
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