【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于酶的基因工程，具體涉及一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌及其應用。
技術介紹
1、l-巖藻糖(6-脫氧-l-半乳糖)具有益生元活性，可以保護腸道屏障功能，改善脂質代謝，還表現出抗腫瘤活性和延緩皮膚衰老的作用，因此在制藥、保健品和化妝品行業中具有作為生物活性成分的潛力。相比于藻類提取和化學合成，用合成生物學的方式合成l-巖藻糖具有綠色環保、成本低廉的優勢，是極具潛力的l-巖藻糖合成方式。
2、而目前，利用代謝工程微生物合成l-巖藻糖，通常是從用于2′-巖藻基乳糖合成的代謝工程大腸桿菌株的出發，使用外源添加的乳糖作為糖基受體合成2′-巖藻基乳糖，再進一步引入特異性的α-l-巖藻糖苷酶，將2′-巖藻基乳糖水解為l-巖藻糖和乳糖，但此方法目前研究報道的產量較低，為此，我司對菌株進行了進一步的改造和優化，如申請號為cn202310014321.6_的中國專利所述，但其l-巖藻糖產量也僅能達到51.05g/l，雖然獲得了極大提高，但是仍舊有待提高，此外，其所構建的菌株中承載2種質粒載體，需要添加2種抗生素進行菌株的發酵培養，不利于大規模的工業化生產，且在l-巖藻糖的提取過程中還需要去除抗生素，且存在抗生素殘留問題。
3、因此，如果構建一種無需抗生素、且高產的產l-巖藻糖的工程大腸桿菌，對于提升l-巖藻糖的工業化生產進程、簡化l-巖藻糖的提取工序顯得至關重要。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供了一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌及其應
2、為實現上述目的，本專利技術所采取的技術方案如下：
3、一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌，在大腸桿菌為出發菌株，進行如下a-f項的改造獲得；
4、a、敲除β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂質載體轉移酶基因wcaj；
5、b、利用強組成型啟動子pj23119啟動表達磷酸甘露糖變位酶-甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因簇manc-manb
6、c、利用強組成型啟動子pj23119啟動表達表達gdp-甘露糖-6-脫氫酶-gdp-巖藻糖合成酶基因簇gmd-wcag；
7、d、在reca位點、arsb位點和ldha位點整合α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因bkht，
8、e、敲除巖藻糖異構酶-l-巖藻糖激酶基因簇fuci-fuck；
9、f、整合α-l-巖藻糖苷酶基因afca。
10、作為進一步的技術方案，將α-l-巖藻糖苷酶基因afca整合到fucik位點，其中，fucik為fuci-fuck的簡寫。
11、作為進一步的技術方案，所述大腸桿菌，還進行了如下g和f項的改造：
12、g、利用質粒prsfduet-1游離表達磷酸甘露糖變位酶-甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因簇manc-manb和gdp-甘露糖-6-脫氫酶-gdp-巖藻糖合成酶基因簇gmd-wcag；
13、h、利用質粒petduet-1游離表達正轉錄調控因子rcsa和rcsb以及α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因bkht。
14、作為進一步的技術方案，正轉錄調控因子rcsa和rcsb來源于大腸桿菌k-12mg1655。
15、作為進一步的技術方案，所述大腸桿菌，還進行了如下i項的改造：
16、i：利用所述質粒petduet-1對磷酸甘露糖變位酶基因manc、甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脫氫酶基因gmd、gdp-巖藻糖合成酶基因wcag中的一種或多種進行強化表達，優選的，對甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因manb進行強化表達。本專利技術游離表達的來源于大腸桿菌k-12mg1655的rcsa、rcsb正轉錄調控因子和bkht，將其克隆至petduet-1的質粒上，得到pet-rcsab-bkht質粒，并通過質粒優化加強前體供應，并獲得穩定遺傳的質粒。
17、作為進一步的技術方案，所述大腸桿菌，還進行了如下j、k項的改造：
18、j：在所述質粒prsfduet-1的cdf?ori和laci位點之間插入hok/sok系統；本專利技術通過插入hok/sok系統解決發酵過程的抗生素依賴問題，hok/sok系統是毒素-抗毒素系統，通過編碼強毒性的跨膜蛋白hok造成不可逆的膜結構損傷，而反義rna順式編碼的sok可以阻斷hok蛋白的表達。導入了含有hok/sok系統的質粒的細胞中，sokrna與激活的hokmrna結合，由此阻斷hokmrna與核糖體結合，從而抑制強毒性跨膜蛋白hok蛋白的表達。當細胞中無質粒時，sokrna迅速降解，hokmrna由于衰長而使得毒性蛋白得以充分表達和聚集，最終導致細胞死亡。
19、k：敲除所述大腸桿菌上的硫腺苷激酶基因cysc，并將硫腺苷激酶基因cysc克隆到所述質粒petduet-1上；cysc是細菌硫代謝途徑中的關鍵酶，負責催化無機硫酸鹽轉化為活性硫酸鹽，進而參與半胱氨酸的生物合成。本專利技術通過敲除cysc基因，構建cysc基因缺陷型菌株，用于維持質粒穩定性。營養缺陷型系統是一種有效的質粒維持策略，它涉及在宿主菌株中敲除或突變某個必需營養因子的合成途徑上的關鍵基因，使得菌株無法合成該營養因子，從而在沒有外部補充該因子的培養基中無法生長。通過在質粒上插入相應的野生型基因，質粒的存在使得菌株能夠補償其營養缺陷，從而在不補充該營養因子的培養基中生長。通過這種方式，質粒的維持與宿主菌株的生長和生存直接相關，從而顯著提高了質粒的穩定性。在不使用抗生素的情況下，這種營養缺陷型系統為質粒的穩定維持提供了一種有效的選擇機制，保證了工程菌株在長期培養和大規模發酵過程中的性能穩定。
20、作為進一步的技術方案，質粒petduet-1上，第一個多克隆位點表達轉錄調控因子rcsa、rcsb；
21、作為進一步的技術方案，質粒petduet-1上，第二個多克隆位點表達α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因bkht；
22、作為進一步的技術方案，敲除所述宿主細胞上編碼硫腺苷激酶的基因cysc，所述質粒petduet-1還攜帶有基因cysc。
23、作為進一步的技術方案，所述α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因bkht來源于幽門螺桿菌屬helicobacter?sp.13s00401-1。
24、作為進一步的技術方案，磷酸甘露糖變位酶-甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因簇manc-manb來源于escherichia?coli，其中，磷酸甘露糖酶基因manb的genbank號為np_416552.1，甘露糖1-鳥苷酸轉移酶編碼基因manc的genbank號為np_416553.1；其具體核苷酸序列公眾可獲知，在此不在贅述；
25、作為進一步的技術方案，gdp-甘露糖-6-脫氫酶-gdp-巖藻糖合成本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種產L-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，在大腸桿菌為出發菌株，進行如下A-F項的改造獲得；
2.根據權利要求1所述的一種產L-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，將α-L-巖藻糖苷酶基因afcA整合到fucIK位點。
3.根據權利要求1所述的一種產L-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌，還進行了如下G和F項的改造：
4.根據權利要求2所述的一種產L-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌，還進行了如下I項的改造：
5.根據權利要求3或4所述的一種產L-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌，還進行了如下J、K項的改造：
6.根據權利要求5所述的一種產L-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，
7.根據權利要求1所述的產L-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌包括E.coli?BL21(DE3)、E.coli?K-12，E.coli?Top10中的一種或幾種。
8.如權利要求1所述的產L-巖藻糖的工程大腸桿菌在生產L-巖藻糖中的應用。
9.一種生產
10.根據權利要求9所述的生產L-巖藻糖的方法，其特征在于，所述發酵培養，以甘油為碳源，以乳糖為底物。
...【技術特征摘要】
1.一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，在大腸桿菌為出發菌株，進行如下a-f項的改造獲得；
2.根據權利要求1所述的一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，將α-l-巖藻糖苷酶基因afca整合到fucik位點。
3.根據權利要求1所述的一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌，還進行了如下g和f項的改造：
4.根據權利要求2所述的一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌，還進行了如下i項的改造：
5.根據權利要求3或4所述的一種產l-巖藻糖的工程大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌，還進行了如下j、k項的改造：
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