【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程，具體涉及一種少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、經(jīng)冷膠是經(jīng)少動鞘氨醇單胞菌(sphingomonas?paucimbilis)有氧發(fā)酵生產(chǎn)的一種由β-1，3-d葡萄糖、β-1，4-d-葡萄糖醛酸、β-1,4-d-葡萄糖、α-1,4-l-鼠李糖連接構(gòu)成的線性微生物多糖，其每個重復(fù)單元的第一個葡萄糖殘基含0.5個乙酰基和1個甘油酰基。由于酰基的含量影響著結(jié)冷膠的性質(zhì)，而在面對不同應(yīng)用時往往需要選擇不同性能的結(jié)冷膠。據(jù)此，越來越多的研究通過降低結(jié)冷膠酰基含量，改變其凝膠特性，以滿足生產(chǎn)需求，并進一步擴大結(jié)冷膠的應(yīng)用范圍。傳統(tǒng)降低酰基含量的方法是在堿性條件下加熱水解，這不但浪費了大量能源而且條件還不易控制，甚至?xí)?dǎo)致主鏈的水解。因此，通過基因工程手段改造發(fā)酵菌種，直接從源頭上發(fā)酵生產(chǎn)出不同酰基含量的結(jié)冷膠具有重要意義。在s.paucimobilis結(jié)冷膠生物合成途徑中，已經(jīng)明確的是oafa基因編碼的乙酰基轉(zhuǎn)移酶負責(zé)催化多糖主鏈上乙酰基的加成，因此，利用代謝工程對乙酰基轉(zhuǎn)移酶的表達量進行調(diào)控是最好的選擇。
2、而近年來出現(xiàn)的crispri技術(shù)能在mrna水平上降低目標基因的表達，且由于該技術(shù)不會造成目標dna的雙鏈斷裂，因此非常適合應(yīng)用于遺傳背景不明的非模式菌株s.paucimobilis。但現(xiàn)有已報道的crispri/dcas9系統(tǒng)在s.paucimobilis中進行目的基因的表達，仍存在轉(zhuǎn)化效率低的問題。
技術(shù)實現(xiàn)
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本專利技術(shù)所述系統(tǒng)能夠在少動鞘氨醇單胞菌中穩(wěn)定表達，抑制基因的轉(zhuǎn)錄，來降低特定基因的表達，而不修改其dna序列，對s.paucimobilis有較小的毒性，宿主生長速度快，且能夠?qū)崿F(xiàn)dcas12a的高效表達。
2、本專利技術(shù)提供了一種少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，包括pbbr1-dcas12a-crrna質(zhì)粒，所述pbbr1-dcas12a-crrna質(zhì)粒包括pbbr1復(fù)制子、dcas12a基因、crrna表達盒和氯霉素抗性基因；所述crrna表達盒包括一個ptac啟動子、兩個dr片段和一個rrnb?t1終止子，所述crrna表達盒的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
3、優(yōu)選的是，所述pbbr1復(fù)制子的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述dcas12a基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述氯霉素抗性基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
4、優(yōu)選的是，所述少動鞘氨醇單胞菌包括少動鞘氨醇單胞菌菌株atcc?31461。
5、本專利技術(shù)還提供了上述技術(shù)方案所述少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
6、分別擴增pbbr1復(fù)制子、dcas12a基因、crrna表達盒和氯霉素抗性基因，使用無縫克隆方法連接，得到pbbr1-dcas12a-crrna質(zhì)粒，即為所述少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)。
7、本專利技術(shù)還提供了一種敲低oafa基因表達的少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，所述敲低oafa基因表達的少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)在上述技術(shù)方案所述少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，還含敲低oafa基因表達的sgrna。
8、優(yōu)選的是，所述sgrna插入到crrna表達盒的兩個dr片段之間。
9、優(yōu)選的是，所述sgrna包括針對oafa基因的grna和靶向oafa預(yù)測啟動子的grna；所述針對oafa基因的grna包括oafa1'、oafa2'、oafa3'、oafa4'、oafa5'和oafa6'，所述靶向oafa預(yù)測啟動子的grna包括p1、p2、p3、p4、p5；
10、擴增oafa1'的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.5所示的dcas12a-oafa1'-f和核苷酸序列如seq?id?no.6所示的dcas12a-oafa1'-r；
11、擴增oafa2'的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.7所示的dcas12a-oafa2'-f和核苷酸序列如seq?id?no.8所示的dcas12a-oafa2'-r；
12、擴增oafa3'的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.9所示的dcas12a-oafa3'-f和核苷酸序列如seq?id?no.10所示的dcas12a-oafa3'-r；
13、擴增oafa4'的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.11所示的dcas12a-oafa4'-f和核苷酸序列如seq?id?no.12所示的dcas12a-oafa4'-r；
14、擴增oafa5'的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.13所示的dcas12a-oafa5'-f和核苷酸序列如seq?id?no.14所示的dcas12a-oafa5'-r；
15、擴增oafa6'的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.15所示的dcas12a-oafa6'-f和核苷酸序列如seq?id?no.16所示的dcas12a-oafa6'-r；
16、擴增p1的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.17所示的dcas12a-p1-f和核苷酸序列如seq?id?no.18所示的dcas12a-p1-r；
17、擴增p2的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.19所示的dcas12a-p2-f和核苷酸序列如seq?id?no.20所示的dcas12a-p2-r；
18、擴增p3的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.21所示的dcas12a-p3-f和核苷酸序列如seq?id?no.22所示的dcas12a-p3-r；
19、擴增p4的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.23所示的dcas12a-p4-f和核苷酸序列如seq?id?no.24所示的dcas12a-p4-r；
20、擴增p5的引物包括核苷酸序列如seq?id?no.25所示的dcas12a-p5-f和核苷酸序列如seq?id?no.26所示的dcas12a-p5-r。
21、本專利技術(shù)還提供了上述技術(shù)方案所述敲低oafa基因表達的少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
22、在上述技術(shù)方案所述少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，插入敲低oafa基因表達的sgrna，獲得所述敲低oafa基因表達的少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)。
23、本專利技術(shù)還提供了上述技術(shù)方案本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種少動鞘氨醇單胞菌的CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，包括pBBR1-dCas12a-crRNA質(zhì)粒，所述pBBR1-dCas12a-crRNA質(zhì)粒包括pBBR1復(fù)制子、dCas12a基因、crRNA表達盒和氯霉素抗性基因；所述crRNA表達盒包括一個Ptac啟動子、兩個DR片段和一個rrnB?T1終止子，所述crRNA表達盒的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的少動鞘氨醇單胞菌的CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述pBBR1復(fù)制子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述dCas12a基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述氯霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的少動鞘氨醇單胞菌的CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述少動鞘氨醇單胞菌包括少動鞘氨醇單胞菌菌株ATCC?31461。
4.權(quán)利要求1～3任一項所述少動鞘氨醇單胞菌的CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以
5.一種敲低oafA基因表達的少動鞘氨醇單胞菌CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述敲低oafA基因表達的少動鞘氨醇單胞菌CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)在權(quán)利要求1～3任一項所述少動鞘氨醇單胞菌的CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，還含敲低oafA基因表達的sgRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的敲低oafA基因表達的少動鞘氨醇單胞菌CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述sgRNA插入到crRNA表達盒的兩個DR片段之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的敲低oafA基因表達的少動鞘氨醇單胞菌CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述sgRNA包括針對oafA基因的gRNA和靶向oafA預(yù)測啟動子的gRNA；所述針對oafA基因的gRNA包括oafA1'、oafA2'、oafA3'、oafA4'、oafA5'和oafA6'，所述靶向oafA預(yù)測啟動子的gRNA包括P1、P2、P3、P4、P5；
8.權(quán)利要求5～7任一項所述敲低oafA基因表達的少動鞘氨醇單胞菌CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
9.權(quán)利要求1～3任一項所述少動鞘氨醇單胞菌的CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)在基因干擾少動鞘氨醇單胞菌中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求5～7任一項所述敲低oafA基因表達的少動鞘氨醇單胞菌CRISPRi/dCas12a基因調(diào)控系統(tǒng)在生產(chǎn)酰基化差異的結(jié)冷膠中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，包括pbbr1-dcas12a-crrna質(zhì)粒，所述pbbr1-dcas12a-crrna質(zhì)粒包括pbbr1復(fù)制子、dcas12a基因、crrna表達盒和氯霉素抗性基因；所述crrna表達盒包括一個ptac啟動子、兩個dr片段和一個rrnb?t1終止子，所述crrna表達盒的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述pbbr1復(fù)制子的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述dcas12a基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述氯霉素抗性基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述少動鞘氨醇單胞菌包括少動鞘氨醇單胞菌菌株atcc?31461。
4.權(quán)利要求1～3任一項所述少動鞘氨醇單胞菌的crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
5.一種敲低oafa基因表達的少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas12a基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述敲低oafa基因表達的少動鞘氨醇單胞菌crispri/dcas...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李清揚，劉旭冉，焦天悅，郭寧，王天宜，樊建曄，趙若晗，張禹，趙寶華，
申請(專利權(quán))人：河北師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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