【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學檢測領域，具體地，涉及腹瀉相關病原體的檢測，更具體地，涉及摩氏摩根菌、普羅維登斯菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌、豚鼠氣單胞菌的檢測。
技術介紹
1、摩氏摩根菌(morganella?morganii)又稱摩根氏菌，廣泛分布于水體、土壤及人和動物糞便中，是人體和動物腸道正常菌群成員之一，但也是一種條件致病菌和人獸共患病原菌。摩氏摩根菌的毒力較強，不僅可以引起嚴重感染，甚至可以導致包括人在內的多種動物死亡。還可以引起食物中毒。感染后常出現畏寒、寒戰、發熱、全身酸痛等臨床癥狀，分解體內蛋白產生惡臭味的特征感染癥狀。
2、普羅維登斯菌(providencia)，屬于普羅維登斯菌屬，摩根菌科。目前普羅維登斯菌被分為7個復合群和18個基因種，主要包括雷氏普羅維登斯菌(providencia?rettgeri)、斯氏普羅維登斯菌(providencia?stuartii)和產堿普羅維登斯菌(providenciaalcalifaciens)，容易在免疫功能受損的患者或長期住院患者中引發感染。常常通過接觸傳播，如醫護人員的手部接觸或醫療器械污染等，導致腹瀉等多種感染性疾病的發生。此外，普羅維登斯菌還可成為旅行者腹瀉和其他胃腸道感染的重要致病菌，尤其在衛生條件較差或食品安全控制不嚴的地區。
3、奇異變形桿菌(proteus?mirabilis)為腸桿菌科的革蘭氏陰性菌。作為重要的人畜共患致病菌，奇異變形桿菌在自然界分布廣泛，可引起動物和人胃腸道、呼吸道、泌尿道等感染，是引起食物中毒的主要病原菌，僅次于
4、產氣腸桿菌(enterobacter?aerogenes)是一種主要在人體及動物腸道生存的條件致病菌，屬于腸桿菌科腸桿菌屬革蘭陰性的兼性厭氧桿菌。產氣腸桿菌雖然為人體腸道內正常菌株，但當機體免疫力低下時可引起菌群失調，變成致病性菌種。臨床上產氣腸桿菌致病情況較普遍，且耐藥現象也較嚴重。
5、豚鼠氣單胞菌(aeromonas?caviae)的報道病例顯著增加，已成為一種人、動物和水生生物共患的常見致病菌。其廣泛存在于淡水、海水、污水、土壤、淤泥中，在一定條件下會對動物產生致病性。目前，關于感染豚鼠氣單胞菌的報道主要涉及到人類感染導致的胃腸炎等。
6、因此，本領域需求一種產品能夠簡單、快速地檢測上述病原體，并且具有良好的靈敏度和特異性，能夠檢測并區分引起腹瀉的病原體微生物，以便針對性地為上述腹瀉的防治提供策略。
技術實現思路
1、有鑒于此，第一方面，本專利技術提供一種檢測腹瀉相關病原體的組合物，包括檢測如下病原體中至少4種的上下游引物和探針：
2、如seq?id?no:1～3所示的檢測摩氏摩根菌的上游引物、下游引物及探針；
3、如seq?id?no:4～6所示的檢測普羅維登斯菌的上游引物、下游引物及探針；
4、如seq?id?no:7～9所示的檢測奇異變形桿菌的上游引物、下游引物及探針；
5、如seq?id?no:10～12所示的檢測產氣腸桿菌的上游引物、下游引物及探針；或
6、如seq?id?no:13～15所示的檢測豚鼠氣單胞菌的上游引物、下游引物及探針。
7、本專利技術提供的聯檢的組合物，主要利用多重熒光pcr分析方法，通過檢測不同病原體上的靶點，對不同病原體進行檢測，從而在單管反應體系中同時實現摩氏摩根菌、普羅維登斯菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌，以及豚鼠氣單胞菌中至少4種的檢測和區分，以便為腹瀉防治提供針對性策略。本專利技術的組合物，其檢測的靈敏度更高，達到500拷貝/ml，特異性好，檢測更為準確，能夠提供較為充分的快速檢測以及排除不同病原體感染的依據，縮短腹瀉誘因的判斷時間，加快實施應對措施。
8、進一步地，本專利技術提供一種檢測腹瀉相關病原體的組合物，包括：
9、如seq?id?no:1～3所示的檢測摩氏摩根菌的上游引物、下游引物及探針；
10、如seq?id?no:4～6所示的檢測普羅維登斯菌的上游引物、下游引物及探針；
11、如seq?id?no:7～9所示的檢測奇異變形桿菌的上游引物、下游引物及探針；
12、如seq?id?no:10～12所示的檢測產氣腸桿菌的上游引物、下游引物及探針；以及
13、如seq?id?no:13～15所示的檢測豚鼠氣單胞菌的上游引物、下游引物及探針。
14、進一步地，所述組合物包括檢測內標的上游引物、下游引物及探針。
15、在一些具體的實施方案中，針對樣本添加外源性內標，進一步地，所述內標是人源內標基因。
16、在一個具體的實施方案中，內標是rnase?p或者gapdh。
17、進一步地，本專利技術組合物檢測不同病原體的探針之間的熒光基團彼此互不相同且互不干擾。
18、在本文中，“互不相同且互不干擾”是指組合物中每個探針所用的熒光基團是不一樣的，并且不會影響彼此的檢測，即可以利用不同的通道進行檢測。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，這些基團吸光值不接近，能選擇不同的通道，因而不會互相干擾。
19、在一些具體的實施方案中，檢測摩氏摩根菌的探針的熒光報告基團為fam；檢測普羅維登斯菌的探針的熒光報告基團為hex；檢測奇異變形桿菌的探針的熒光報告基團為rox；檢測產氣腸桿菌的探針的熒光報告基團為cy5；檢測豚鼠氣單胞菌的探針的熒光報告基團為quasar?705。
20、進一步地，在一些實施方案中，本專利技術的組合物可以同時包括上述引物和探針對中的一組或多組。在本專利技術中，“組”是指檢測一個靶點的互相匹配的上游引物、下游引物和探針。
21、本專利技術的組合物可以任意組合成檢測對應5個靶點的任意組合形式。本領域技術人員可以根據需要進行組合，檢測哪幾個靶點，即把對應靶點的上下游引物和探針對進行組合即可。這些組合形式均包括在本專利技術中。
22、舉例來說，可以包括上述5組引物和探針中的任意4組，可以包括上述5組引物和探針中的任意3組，也可以包括上述5組引物和探針中的任意2組，也可以包括上述5組引物和探針中的任意1組。
23、在一些具體的實施方案中，本專利技術組合物用于熒光pcr。
24、進一步地，探針的3’末端還具有非熒光淬滅劑。
25、進一步地，探針的3’末端還具有淬滅基團，例如bhq1或bhq2。
26、在一個具體的實施方案中，探針的3’末端的淬滅基團為bhq1。
27、在一個具體的實施方案中，本專利技術的組合物的各成分分別存在于單獨包裝中。
28、在一個具體的實施方案中，本專利技術的組合物的各成分存在于同一個包裝中。
29、進一步地，本專利技術的組合物的各成分以混合的形式存在。
30、第二方面本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種檢測腹瀉相關病原體的組合物，包括檢測如下病原體中至少4種的上下游引物和探針：
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括：
3.根據權利要求2所述的組合物，其特征在于，檢測不同病原體的探針之間的熒光基團彼此互不相同且互不干擾。
4.根據權利要求1～3中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括檢測內標的上游引物、下游引物及探針。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述組合物的各成分以混合的形式存在。
6.根據權利要求1～5中任一項所述的組合物在制備檢測腹瀉相關病原體的試劑盒中的用途，其中，所述病原體為產氣腸桿菌、摩氏摩根菌、普羅維登斯菌、奇異變形桿菌，或豚鼠氣單胞菌中的一種或多種。
7.一種檢測腹瀉相關病原體的試劑盒，所述試劑盒包括如權利要求1～5中任一項所述的組合物。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性質控品和陽性質控品。
9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：核酸釋放試劑、核酸提取試劑
10.一種組合物用于制備檢測腹瀉相關病原體的試劑的用途，所述檢測包括以下步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種檢測腹瀉相關病原體的組合物，包括檢測如下病原體中至少4種的上下游引物和探針：
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括：
3.根據權利要求2所述的組合物，其特征在于，檢測不同病原體的探針之間的熒光基團彼此互不相同且互不干擾。
4.根據權利要求1～3中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括檢測內標的上游引物、下游引物及探針。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述組合物的各成分以混合的形式存在。
6.根據權利要求1～5中任一項所述的組合物在制備檢測腹瀉相關病原體的試劑盒中的用途...
【專利技術屬性】
技術研發人員：顏新林，段菲菲，羅磊，豐雪，萬旺，吳康，戴立忠，
申請(專利權)人：圣湘生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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