【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及酶催化劑，具體為一種胺脫氫酶催化體系及其應用，以及該催化體系所使用的低共熔溶劑及其制備。
技術介紹
1、手性胺是一類非常重要的結構單元，存在于許多重要化合物和生物活性分子中，美國fda批準的化學藥物中有約40％的藥物都具有手性胺結構。常見的手性胺合成法有化學合成與生物催化，化學合成法常利用金屬催化劑進行不對稱合成，但這種催化方法往往需要嚴苛的反應條件并伴隨著重污染等問題；生物催化中的酶法催化反應，因其綠色、環保的優勢成為手性胺合成手段的熱門研究方向。
2、手性胺合成過程涉及的酶包含轉氨酶、亞胺還原酶、還原性胺酶、單胺氧化酶和胺脫氫酶等，其中胺脫氫酶是一類依賴輔酶nad(p)h進行還原胺化的酶，因其能夠將廉價的氨作為氨供體、且副產物只生成水的優點在近年來成為研究熱點。盡管對胺脫氫酶的研究從基因改造到固定化應用均有涉及，但這些方法普遍存在周期長、難度大、載體制作成本高、不穩定等缺陷，因此尋找一種綠色、便捷、低成本的方法來提高胺脫氫酶的酶活和穩定性，并實現手性胺的高效催化，成為具有價值和挑戰的技術問題。
技術實現思路
1、為了解決現有酶法催化合成手性胺技術存在的不足，本專利技術開發出一種胺脫氫酶催化體系，利用由羧酸銨鹽作為氫鍵供體組成的低共熔溶劑來提高胺脫氫酶以及葡萄糖脫氫酶的催化活性和穩定性，用于催化手性胺的不對稱合成，實現對手性胺的高效催化合成、輔酶循環再生和高穩定性。
2、為實現上述目的，本專利技術提供的胺脫氫酶催化體系，包括低共熔溶劑和緩沖溶
3、低共熔溶劑(deep?eutectic?solvents，des)是近年來開發的一種新型綠色環保溶劑，由氫鍵供體和氫鍵受體按照一定配比組成，是具有低熔點的多元混合物，其與離子液體不同之處在于des通常由自然界中存在的天然物質所組成，因此其具有的無毒無害、可生物降解、經濟、制備方便等優勢，在載體制備、混合物的分離提取、高分子化學、生物催化等領域得以體現。
4、本專利技術將低共熔溶劑引入手性胺催化合成反應體系，針對胺脫氫酶的特性，篩選出羧酸銨鹽這一不同于常用氫鍵供體的物質用作氫鍵供體，與氫鍵受體氯化膽堿或甜菜堿組成des，再結合緩沖溶液形成胺脫氫酶催化體系，實現胺脫氫酶對手性胺合成反應的高效催化。
5、作為對上述技術方案的限定，所述羧酸銨鹽選用甲酸銨、乙酸銨、丙酸銨中的任一種。
6、作為對上述技術方案的限定，氫鍵受體和氫鍵供體的摩爾比4:1～1:3，作為優選，最佳摩爾比1:1～1:3。
7、作為對上述技術方案的限定，所述緩沖溶液選用氯化銨-氨水緩沖溶液，作為優選，緩沖溶液的ph為8.0～10.5。
8、作為對上述技術方案的限定，在低共熔溶劑和緩沖溶液中加入胺脫氫酶，再加入葡萄糖脫氫酶，形成雙酶體系；作為優選，胺脫氫酶與葡萄糖脫氫酶的加入量按酶活計配比為1:0.1～1:4。
9、進一步完善低共熔溶劑的組成、配比，緩沖溶液的組成、ph以及雙酶體系，以優化催化體系的活性和穩定性。
10、同時，本專利技術提供了如上所述胺脫氫酶催化體系的應用，即用作由酮合成對應手性胺反應的催化體系，作為優選，反應原料酮選擇β位的雜芳基酮。
11、作為對上述技術方案的限定，使用胺脫氫酶催化體系催化4-氟苯基丙酮合成(r)4-氟苯基丙胺；作為優選，
12、由4-氟苯基丙酮、葡萄糖、nadh、氯化銨-氨水緩沖溶液、低共熔溶劑以及胺脫氫酶和葡萄糖脫氫酶配成反應體系，在20～60℃震蕩反應，合成(r)4-氟苯基丙胺；
13、進一步反應體系總量為5ml，反應體系中4-氟苯基丙酮的加入濃度為50～500mm，葡萄糖的加入濃度為60～600mm，nadh的加入濃度為1mm，低共熔溶劑的加入量為250～750μl即加入量按體積分數計為5～15％v/v，胺脫氫酶的酶活加入量為8u，葡萄糖脫氫酶的酶活加入量為8u，使用2m氯化銨-氨水緩沖溶液定量反應體系，在20～60℃下震蕩反應2～12h。
14、本專利技術將由胺脫氫酶與葡萄糖脫氫酶溶于des-緩沖溶液體系形成的催化體系，用于酮尤其β位雜芳基酮合成手性胺反應，實現對合成反應的高效催化及反應中輔酶的循環再生和雙酶高穩定性。
15、此外，本專利技術還提供了如上所述的低共熔溶劑，即以氯化膽堿或甜菜堿為氫鍵受體，以羧酸銨鹽尤其甲酸銨、乙酸銨、丙酸銨中任一種為氫鍵供體形成的低共熔溶劑，能提高胺脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的催化活性和穩定性。
16、作為對上述技術方案的限定，所述低共熔溶劑為甜菜堿-乙酸銨，甜菜堿和乙酸銨的用量配比為摩爾比1:2。
17、應用于生物催化領域的低共熔溶劑，其氫鍵供體選擇多為中性組分，如尿素、甘油、乙二醇等，這些常用氫鍵供體所組成的des對于β位雜芳基酮的合成反應轉化率無明顯提升作用，有些還有抑制作用。另外，酸性氫鍵供體組分，由于其ph對反應體系的酸堿性影響顯著，進而影響酶活，故由酸性氫鍵供體組成的低共熔溶劑很少應用于酶催化反應。本專利技術創新地以羧酸銨鹽為氫鍵供體組成低共熔溶劑，不僅能提高胺脫氫酶與葡萄糖脫氫酶的雙酶活性、穩定性，還能顯著提升合成反應轉化率。
18、再者，本專利技術也提供了低共熔溶劑的制備，是將氫鍵受體與氫鍵供體按比例混合，在80～90℃下充分攪拌，制成穩定均一的溶液；若在上述條件無法形成穩定均一溶液，在加熱攪拌過程再加入少量超純水。
19、常用的低共熔溶劑制備方法有蒸發法、加熱攪拌法、冷凍干燥法、研磨法、和微波法等，本專利技術采用加熱攪拌法，操作簡便、穩定性高，利于廣泛應用。
20、綜上所述，本專利技術提供了一種利用羧酸銨鹽作為氫鍵供體的des構建的胺脫氫酶催化體系，能同時提高胺脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的雙酶酶活、ph穩定性、儲藏穩定性與熱穩定性，進而使單位時間和單位酶活的酶促酮還原胺化的轉化率得到顯著提高，且使用的des無毒無害、易操作、易降解，利于優化工藝過程，降低生產成本。
21、本專利技術還通過對des的摩爾比、含水量與單組分的優化，最終選擇最優des甜菜堿-乙酸銨，成功提高了胺脫氫酶和葡萄糖脫氫酶在酮還原胺化反應過程中的酶活以及穩定性，加強胺脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的酶學性質，提升催化反應的速率、輔因子循環能力以及反應持續時間，并運用分子動力學模擬和分子對接對機理進行推測與解釋，實現對胺脫氫酶催化體系的優化，利于綠色、便捷、低成本酮還原胺化合成方法的開發和應用。
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1.一種胺脫氫酶催化體系，其特征在于：包括低共熔溶劑和緩沖溶液，所述低共熔溶劑以氯化膽堿或甜菜堿為氫鍵受體，以羧酸銨鹽為氫鍵供體。
2.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：所述羧酸銨鹽選用甲酸銨、乙酸銨、丙酸銨中的任一種。
3.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：氫鍵受體和氫鍵供體的摩爾比4:1～1:3，作為優選，最佳摩爾比1:1～1:3。
4.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：所述緩沖溶液選用氯化銨-氨水緩沖溶液，作為優選，緩沖溶液的pH為8.0～10.5。
5.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：在低共熔溶劑和緩沖溶液中加入胺脫氫酶，再加入葡萄糖脫氫酶，形成雙酶體系；作為優選，胺脫氫酶與葡萄糖脫氫酶的加入量按酶活計配比為1:0.1～1:4。
6.如權利要求1～5中任一項所述胺脫氫酶催化體系的應用，其特征在于：用作由酮合成對應手性胺反應的催化體系，作為優選，反應原料酮選擇β位的雜芳基酮。
7.根據權利要求6所述胺脫氫酶催化體系的應用，其特征在于：使用胺脫氫酶
8.一種如權利要求1～5中任一項所述的低共熔溶劑，其特征在于：以氯化膽堿或甜菜堿為氫鍵受體，以羧酸銨鹽為氫鍵供體形成的低共熔溶劑，能提高胺脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的催化活性和穩定性。
9.根據權利要求8所述低共熔溶劑，其特征在于：所述低共熔溶劑為甜菜堿-乙酸銨，甜菜堿和乙酸銨的用量配比為摩爾比1:2。
10.一種如權利要求8所述低共熔溶劑的制備，其特征在于：將氫鍵受體與氫鍵供體按比例混合，在80～90℃下充分攪拌，制成穩定均一的溶液。
...【技術特征摘要】
1.一種胺脫氫酶催化體系，其特征在于：包括低共熔溶劑和緩沖溶液，所述低共熔溶劑以氯化膽堿或甜菜堿為氫鍵受體，以羧酸銨鹽為氫鍵供體。
2.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：所述羧酸銨鹽選用甲酸銨、乙酸銨、丙酸銨中的任一種。
3.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：氫鍵受體和氫鍵供體的摩爾比4:1～1:3，作為優選，最佳摩爾比1:1～1:3。
4.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：所述緩沖溶液選用氯化銨-氨水緩沖溶液，作為優選，緩沖溶液的ph為8.0～10.5。
5.根據權利要求1所述胺脫氫酶催化體系，其特征在于：在低共熔溶劑和緩沖溶液中加入胺脫氫酶，再加入葡萄糖脫氫酶，形成雙酶體系；作為優選，胺脫氫酶與葡萄糖脫氫酶的加入量按酶活計配比為1:0.1～1:4。
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【專利技術屬性】
技術研發人員：周麗亞，鄭珂，劉運亭，姜艷軍，賀瑩，馬麗，鄭曉冰，劉冠華，
申請(專利權)人：河北工業大學，
類型：發明
國別省市：
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