【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物工程與農(nóng)殘檢測(cè)，尤其是一種基于固定化植物酯酶的雙酶比色法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、生態(tài)環(huán)境中的有機(jī)磷農(nóng)藥(ops)通過(guò)食物鏈對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成巨大威脅，迫使ops分析方法的快速發(fā)展。目前，農(nóng)藥殘留的金標(biāo)準(zhǔn)方法較多，包括：氣相色譜法、質(zhì)譜法，配備不同檢測(cè)器得高壓液相色譜法。然而，這些方法缺點(diǎn)明顯，如費(fèi)用較高、前處理過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)、需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，嚴(yán)重限制了這些方法對(duì)ops的快速檢測(cè)。在此背景下，作為最具潛力的檢測(cè)方法之一，基于酶抑制原理的比色法引人關(guān)注，這類(lèi)方法往往不需要復(fù)雜的儀器，結(jié)果直觀(guān)，適合快速檢測(cè)，但這類(lèi)方法往往對(duì)檢測(cè)用酶的要求較高，往往需要檢測(cè)用酶對(duì)所檢測(cè)的ops具有高敏感性和較高的穩(wěn)定性。目前，乙酰膽堿酯酶(ache)是目前該法最常用的檢測(cè)用酶，該酶能酶解硫代乙酰膽堿(atci)，但該酶成本較高、對(duì)環(huán)境(ph，溫度)的穩(wěn)定性較低，因此，需要找尋穩(wěn)定性強(qiáng)、易于制備、高催化活性和低成本的理想檢測(cè)用酶。植物源α-醋酸萘酯酶(anae，ec?3.1.1.x)能被ops識(shí)別并抑制，作用與ache類(lèi)似。此外，該酶來(lái)源豐富(塊莖類(lèi)、木本類(lèi)、草本類(lèi)、谷物和豆類(lèi)中)、成本較低，是一種有潛力的ache替代品。然而，和其他酶一樣，該酶存在不穩(wěn)定、易喪失活性、親和力不高等缺點(diǎn)，特別是對(duì)某些極端條件穩(wěn)定性低，限制了它的應(yīng)用。而解決這一問(wèn)題的有效方式是將靶酶固定在高分子聚合物或無(wú)機(jī)載體基質(zhì)中，增強(qiáng)酶的儲(chǔ)存和操作穩(wěn)定性。
2、殼聚糖(cts)是一種由具有β1-4鍵的d-glcn和d-glcnac單體組
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種基于固定化植物酯酶的雙酶比色法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法和應(yīng)用。
2、本專(zhuān)利技術(shù)解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
3、一種基于固定化植物酯酶的雙酶比色法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，包括如下步驟：
4、(1)采用一步法進(jìn)行比色反應(yīng)測(cè)試，繪制測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即將每50μl終濃度1mg/ml固定植物酯酶分別與50μl不同濃度即10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml的有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液混合，空白對(duì)照為蒸餾水，室溫條件下孵育1h后，在反應(yīng)液中依次加入50μl的1μm?hrp、50μl的0.5mm底物乙酸-1-萘酯即1-na、50μl的1.5mm?tmb、50μl的1mm?h2o2、900μl的0.2m，ph?5.0醋酸緩沖液，震蕩5-10s，室溫條件下，避光孵育30min；紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)定659nm的吸光度值a659，根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率i(％)：
5、
6、式中，i為酯酶酶活抑制率；a0為對(duì)照反應(yīng)液在659nm的吸光度值a659；a1為樣品反應(yīng)液在659nm的吸光度值；
7、再以有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液的濃度對(duì)數(shù)值lg為自變量x，以抑制率為應(yīng)變量y，利用excel軟件建立一元一次線(xiàn)性回歸方程，y＝ax+b；
8、(2)取待測(cè)樣品處理液50μl，按照步驟(1)進(jìn)行操作，計(jì)算抑制率i，代入上述步驟(1)中濃度線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)性方程，求出待測(cè)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥濃度。
9、進(jìn)一步地，所述方法利用戊二醛ga對(duì)殼聚糖cts表面進(jìn)行胺化，隨后再與甘氨酸gly之間進(jìn)行交聯(lián)，制備一種新的cts/ga/gly復(fù)合材料。利用簡(jiǎn)單物理吸附原理固定植物酯酶，以固定植物酯酶為檢測(cè)酶，底物乙酸-1-萘酯1-na在酶的催化下生成具有還原活性的1-n，能抑制hrp誘導(dǎo)的tmb/h2o2體系的顯色/比色變化，根據(jù)酶抑制法原理，ops能抑制這種顯色反應(yīng)，而且和ops的量成比例關(guān)系；據(jù)此，成功專(zhuān)利技術(shù)了一種基于固定植物酯酶的雙酶比色法，用于檢測(cè)ops的雙酶比色法。
10、進(jìn)一步地，所述植物酯酶來(lái)源于綠豆，制備步驟如下：
11、將每40g綠豆磨成粉末，加入200ml去離子水diw攪拌40min，3000rpm室溫離心20min，收集上清20.0ml，在4℃條件下分別加入不同飽和度即20-90％硫酸銨梯度純化，靜置12h，8000rpm離心10min，收集沉淀，用0.02mol/l、ph7.5的pbs緩沖液溶解后，使用預(yù)先用4倍于純化柱體積的0.02mol/l、ph7.5pbs緩沖液平衡的二乙氨乙基(deae)-纖維素陰離子交換柱(長(zhǎng)度×直徑：50mm×16mm)純化，以同樣緩沖液洗脫，流速30ml/h，收集餾分，于5℃、1645g離心25min，用30kda的超濾管中超濾，取濃縮酶解液過(guò)sephadex?g-25凝膠柱層析柱，用緩沖液洗脫，流速為30ml/h，收集3ml餾分，合并595nm吸光度較高的餾分，真空濃縮，得純化植物酯酶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
12、進(jìn)一步地，所述固定植物酯酶的制備步驟如下：
13、1)殼聚糖gts凝膠制備：按照1:5的比例g：ml將殼聚糖粉浸入體積百分?jǐn)?shù)為5％的冰醋酸溶液中，25℃、1000rpm條件下機(jī)械攪拌4h，按照殼聚糖溶液：naoh溶液的體積比為1:10滴入濃度為0.1m的naoh溶液，繼續(xù)1000rpm攪拌過(guò)夜，制備得到殼聚糖凝膠粗品；過(guò)濾，蒸餾水沖洗至ph＝7.0，得到殼聚糖凝膠即cts凝膠，置于體積濃度70％乙醇溶液，4℃貯存；
14、2)戊二醛ga活化的殼聚糖凝膠gts/ga制備：配置戊二醛工作液：將ph?7.0、0.2m磷酸二氫鈉溶液與體積濃度25％戊二醛溶液按照體積比11.2:16.8的比例混合，得到新配置戊二醛工作液，隨后，將殼聚糖凝膠按照比例g：ml為10：28的比例添加到新配置的戊二醛工作液中，25℃，200rpm連續(xù)機(jī)械攪拌1h，制備得到戊二醛活化的殼聚糖凝膠粗品，用去離子水徹底清洗殼聚糖凝膠，用濾紙過(guò)濾去除多余的水分，得到戊二醛活化的殼聚糖凝膠即cts/ga凝膠；
15、3)cts/ga/gly復(fù)合固定材料制備：將cts/ga凝膠置于0.5m、ph?8.0的甘氨酸gly溶液中，cts/本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于固定化植物酯酶的雙酶比色法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法利用戊二醛GA對(duì)殼聚糖CTS表面進(jìn)行胺化，隨后再與甘氨酸Gly之間進(jìn)行交聯(lián)，制備一種新的CTS/GA/Gly復(fù)合材料。利用簡(jiǎn)單物理吸附原理固定植物酯酶，以固定植物酯酶為檢測(cè)酶，底物乙酸-1-萘酯1-NA在酶的催化下生成具有還原活性的1-N，能抑制HRP誘導(dǎo)的TMB/H2O2體系的顯色/比色變化，根據(jù)酶抑制法原理，OPs能抑制這種顯色反應(yīng)，而且和OPs的量成比例關(guān)系；據(jù)此，成功專(zhuān)利技術(shù)了一種基于固定植物酯酶的雙酶比色法，用于檢測(cè)OPs的雙酶比色法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物酯酶來(lái)源于綠豆，制備步驟如下：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定植物酯酶的制備步驟如下：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述雙酶為固化綠豆酯酶和辣根過(guò)氧化物酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述樣品處理液的制備方法：果蔬樣品洗凈后切成小塊，加入丙酮，
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述有機(jī)磷農(nóng)藥為敵敵畏。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述方法的檢測(cè)范圍為10～100ng/mL范圍。
9.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法在果蔬中OPs殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于固定化植物酯酶的雙酶比色法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法利用戊二醛ga對(duì)殼聚糖cts表面進(jìn)行胺化，隨后再與甘氨酸gly之間進(jìn)行交聯(lián)，制備一種新的cts/ga/gly復(fù)合材料。利用簡(jiǎn)單物理吸附原理固定植物酯酶，以固定植物酯酶為檢測(cè)酶，底物乙酸-1-萘酯1-na在酶的催化下生成具有還原活性的1-n，能抑制hrp誘導(dǎo)的tmb/h2o2體系的顯色/比色變化，根據(jù)酶抑制法原理，ops能抑制這種顯色反應(yīng)，而且和ops的量成比例關(guān)系；據(jù)此，成功發(fā)明了一種基于固定植物酯酶的雙酶比色法，用于檢測(cè)ops的雙酶比色法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物酯酶來(lái)源于綠豆，制備步驟如下：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定植物酯酶的制...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉昊，李玨，何慶峰，張愛(ài)琳，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：和田職業(yè)技術(shù)學(xué)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。