【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法。
技術介紹
1、菌群移植是一種將健康供體糞便中的腸道菌群移植給患者，從而調整或重建患者腸道菌群平衡的新技術，但由于目前國內外該領域處于發展萌芽期，因此存在許多技術瓶頸與壁壘。
2、首先，供體在移植前盡管經過嚴格的篩選以確保其微生物群體的安全性和多樣性，但仍不可避免地存在有潛在的風險和安全隱患，其原因在于供體糞便中除腸道菌群外還含有各種腸道內容物、未消化的食物殘渣、菌群代謝產物等。對于腸道內容物和未消化的食物殘渣而言，其可能攜帶有病原體，如病毒或寄生蟲，這些病原體可能通過移植過程傳播給患者，增加感染的風險，此外，這些物質還可能含有抗營養因子，這些因子能夠抑制營養素的吸收，影響患者的營養價值攝入，可能導致營養不良或加劇已有的營養問題。對于菌群代謝產物而言，如短鏈脂肪酸、氨基酸及其衍生物、膽汁酸、硫化氫等，雖然在正常生理狀態下對宿主有益，但在菌群移植過程中，如果這些代謝物的量和比例失衡，可能會對患者的生理和病理過程產生不利影響，例如，短鏈脂肪酸的產生與飲食、菌群組成和患者自身健康系統有關，如果代謝物循環水平不當，可能會影響患者的健康，導致代謝紊亂或腸道屏障功能受損；又如，硫化氫已被發現可以通過抑制腸道內胰高血糖素樣肽-1（glp-1）的產生，進而損害機體代謝，促進肥胖等代謝疾病的發生。
3、其次，如何保證供體的腸道菌群在移植至患者體內前保持高活性狀態也是一項重要的技術壁壘，一方面供體可能由于生活方式、飲食習慣或健康狀況而長期保持腸道菌群
4、基于此，目前利用菌群移植技術治療相關疾病的各項案例中，為了保證療效，各研究團隊對移植的總活菌量提出了嚴格的要求，若由于樣本雜質、死菌占比較多，導致菌群菌量、活性下降，最終影響了單次移植的總活菌量，則需要加大服用量或增加移植次數，以目前作為移植途徑之一的口服腸道菌群液體腸溶膠囊為例，由于其膠囊粒徑較大，若加大服用量則會導致患者每次吞咽時較為困難，特別是對于老人與小孩而言，容易造成無法吞咽甚至出現卡喉嚨的危險情況。
5、目前所報道的應用于腸道菌群提取純化、雜質分離的相關技術包括離心法、重懸洗滌法、過濾除雜法以及吸附樹脂法。首先是離心法，該方法通過高速離心產生的力，將糞便樣本中的固體顆粒和液體分離，糞便中的細胞、未消化的食物殘渣等固體顆粒因較大的質量會沉積在底部，而菌群和病毒等微生物則留在上清液中，通過該方法可以有效地去除糞便中的大顆粒雜質；第二是重懸洗滌法，該方法將糞便樣本與生理鹽水或其他緩沖液混合，通過反復重懸和洗滌以去除雜質，通過該方法可以去除一部分大顆粒的物理雜質；第三是過濾除雜法，該方法使用不同孔徑的篩網來過濾糞便樣本，攔截大于篩網孔徑的雜質，如未消化的食物殘渣，進而可以清除糞便中的大顆粒物；而吸附樹脂法則是利用吸附樹脂的大孔結構和高比表面積，通過物理吸附作用去除糞便中的雜質，如代謝產物等，以實現對腸道菌群的提取純化。
6、雖然上述各種方法通過不同的方式對糞便中的雜質進行分離去除，在一定程度上實現對腸道菌群的提取純化，但均存在相應的缺點。首先離心法可能無法有效去除所有非菌雜質，特別是那些顆粒較小或者與菌群相近的物質，實際分離時由于離心產生的對流、擴散，對于一些沉降系數相差不大的組分無法進行完全的分離提純，此外，由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中間損失，造成離心分辨力差的問題，并且多次離心可能會對菌群活性造成影響；重懸洗滌法則需要多次重復洗滌和重懸的步驟，操作較為繁瑣，耗時較長，特別是在處理大量樣本的情況下，其效率較低，且該方法可能會稀釋菌群濃度，且無法保證完全去除所有雜質，而對于粘附性較強的雜質，簡單的重懸和洗滌可能也無法有效的去除；過濾除雜法在面對含有大量雜質的菌懸液時，其濾網很容易達到飽和的狀態，從而造成處理過程中堵塞的情況，導致過濾效率下降，很大程度上限制了上樣量，增加了生產成本、操作成本，僅適用于實驗室處理，難以實現放大化，工業應用上存在困難；而吸附樹脂法則容易受到飽和容量的限制，大孔樹脂的吸附能力有限，一旦飽和，就需要進行再生或更換，這意味著可能需要大量的樹脂和額外的操作成本，且過程復雜繁瑣，并不適用于實際生產環節，此外，吸附樹脂可能無法完全去除所有類型的雜質，特別是那些與樹脂吸附能力不匹配的雜質，甚至容易將菌群吸附，導致菌群收集率下降，與預期效果相反，而部分樹脂由于其帶有特定的官能團，則會對菌群造成殺傷，影響菌群活性。
7、除此之外，上述各種提純除雜方法還存在有一個共同的問題，即無法將活性菌群從死菌及雜質中提取富集，導致供體的腸道菌群在移植至患者體內前無法保持高活性狀態，這將直接影響到移植技術的療效、穩定性、風險性以及患者服用體驗感。造成該問題的原因在于活菌和死菌在細胞壁和膜的完整性上存在差異，活菌具有完整的細胞膜，并具有代謝活性，可以維持其生理功能，利用特定的底物進行能量代謝，而死菌的細胞膜可能已經破裂或受損，故也不具備相關的代謝能力。而上述各種方法如離心法、重懸洗滌法、過濾除雜法主要是基于物理特性進行提純除雜，并非基于死活菌的生理生化特性，故無法完成活性菌群的提取，而吸附樹脂法主要是基于非活性物質的大小、官能團結構等相關性質完成提取分離，然而，這些性質在活菌和死菌之間可能沒有顯著差異，故同樣無法將活菌從死菌及雜質中提取富集。因此，開發一種腸道活性菌群的濃縮富集方法，在操作簡單、耗時短、效率高的前提下，一方面不影響菌群活性、收集率，另一方面提升過濾效率、保證上樣量，并降低生產成本、操作成本，使其實現放大化、工業應用化，最終完成腸道活性菌群的提取純化、死菌及雜質的分離去除，保證移植技術的療效、穩定性及患者服用體驗感，降低相關風險性本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟二所述表面活化液為吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、司班80中的至少一種。
3.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟二所述表面活化液與菌懸液的體積比為1:(60-300)。
4.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟三所述濾膜為尼龍濾膜、聚丙烯濾膜、聚醚砜濾膜中的任意一種；濾膜的孔徑為6-18?μm。
5.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟三所述分離材料為珍珠巖、硅藻土、石英砂、纖維素、膨潤土、高嶺土、二氧化硅、硅酸鎂、聚丙烯酰胺中的至少兩種。
6.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟三所述分離材料的粒徑大小為20-3000?μm，根據分離材料的不同粒徑大小，在布氏漏斗中從下到上依
7.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟三所述分離材料中單一材料與菌懸液的添加比例均為5%-25%，g:mL。
8.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟四所述陽離子溶液為殼聚糖溶液、羧甲基殼聚糖溶液、陽離子化大豆多糖溶液、聚賴氨酸溶液中的至少一種，濃度為0.1%-10%。
9.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟四所述陽離子溶液與菌懸液的體積比為(1-10):1。
10.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟一至步驟四處理過程均在4℃、厭氧條件下進行。
...【技術特征摘要】
1.一種用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟二所述表面活化液為吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、司班80中的至少一種。
3.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟二所述表面活化液與菌懸液的體積比為1:(60-300)。
4.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟三所述濾膜為尼龍濾膜、聚丙烯濾膜、聚醚砜濾膜中的任意一種；濾膜的孔徑為6-18?μm。
5.根據權利要求1所述的用于腸道活性菌群濃縮富集的負壓層級過濾方法，其特征在于，步驟三所述分離材料為珍珠巖、硅藻土、石英砂、纖維素、膨潤土、高嶺土、二氧化硅、硅酸鎂、聚丙烯酰胺中的至少兩種。
6.根據權利要求1所述的用于腸道活性...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張幫周，徐煒，李源濤，林振雄，肖傳興，姚恩峰，廖麗君，何劍全，
申請(專利權)人：上海承葛生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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