【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，尤其涉及一種胞苷-5’-二磷酸的制備方法。
技術(shù)介紹
1、胞苷-5’-二磷酸(cdp，cytidine?diphosphate)是一種核苷酸，組成物是焦磷酸基團(tuán)、五碳糖、以及堿基胞嘧啶，是人體內(nèi)嘧啶核苷酸重要中間產(chǎn)物，是組成rna的重要核苷酸之一，也是人體內(nèi)合成脫氧核糖核苷酸前體。
2、胞苷-5’-二磷酸的鈉鹽可作為生產(chǎn)核酸類藥物的重要中間體、保健食品和生化試劑，并用于制造胞苷三磷酸、聚肌胞苷酸等藥物，在治療多種重大的疾病方面起著重要的作用。
3、現(xiàn)有的胞苷-5’-二磷酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和胞苷-5’-三磷酸減磷法?；瘜W(xué)法是5’-胞苷酸活性基團(tuán)保護(hù)后與有毒的poc13試劑作為磷酸化試劑合成胞苷-5’-二磷酸，反應(yīng)過程中使用有毒試劑，高溫高壓、易爆，生產(chǎn)安全性差，容易造成污染。
4、胞苷-5’-三磷酸減磷法是利用胞苷-5’-三磷酸在己糖激酶作用下與葡萄糖翻譯生產(chǎn)胞苷-5’-二磷酸，但由于胞苷-5’-三磷酸價(jià)格昂貴，缺乏實(shí)用價(jià)值。
5、目前主流的方法采用全細(xì)胞中5’-胞苷酸激酶與多聚磷酸激酶催化合成胞苷-5’-二磷酸過程中由于細(xì)胞本體雜酶的影響，易反應(yīng)生成胞苷-5’-三磷酸等雜質(zhì)，對(duì)后續(xù)純化造成困難。
6、也有不少方法采用5’-胞苷酸為原料，多聚磷酸激酶一步催化反應(yīng)合成胞苷-5’-二磷酸，該方法可以避免產(chǎn)生胞苷-5’-三磷酸等雜質(zhì)，但由于多聚磷酸激酶對(duì)嘧啶核苷酸活力低，轉(zhuǎn)化率低，后續(xù)仍需離子交換柱純化，工藝復(fù)雜。
技
1、有鑒于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N胞苷-5’-二磷酸的制備方法，使用的原料5’-胞苷酸、三磷酸腺苷易購的商品，且相對(duì)廉價(jià)。
2、根據(jù)本申請(qǐng)的一方面，提供了一種胞苷-5’-二磷酸的制備方法，包括原料：5’-胞苷酸，三磷酸腺苷和六偏磷酸鈉；游離酶：5’-胞苷酸激酶，多聚磷酸激酶；以5’-胞苷，三磷酸腺苷和六偏磷酸鈉為原料，用5’-胞苷酸激酶，多聚磷酸激酶進(jìn)行一鍋催化反應(yīng)，合成得到胞苷-5’-二磷酸。
3、在一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，5’-胞苷酸激酶的dna序列為seqidno:1所示，多聚磷酸激酶的dna序列為seq?id?no:3所示。
4、在一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，5’-胞苷酸激酶的氨基酸序列為seq?id?no:2所示，多聚磷酸激酶的氨基酸序列為seq?id?no:4所示。
5、在一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述5’-胞苷酸激酶和所述多聚磷酸激酶分別克隆到外源載體上，所述外源載體上有相對(duì)應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)。
6、在一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述外源載體導(dǎo)入到微生物菌體中，微生物菌體為大腸桿菌，酵母和枯草芽孢桿菌。
7、在一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述5’-胞苷酸激酶，多聚磷酸激酶為固定化酶的形式。
8、在一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，把所述5’-胞苷酸激酶和所述多聚磷酸激酶經(jīng)過同步純化和固定化后在與5’-胞苷，三磷酸腺苷和六偏磷酸鈉進(jìn)行一鍋催化反應(yīng)；
9、所述胞苷-5’-二磷酸的結(jié)構(gòu)式為：
10、
11、在一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述步驟二中的反應(yīng)溫度為37℃，所述步驟三中的反應(yīng)溫度為35℃，所述步驟三的反應(yīng)體系ph為α，所述α的范圍：7.0≤α≤8.0。
12、本專利技術(shù)的有益效果：通過把5’-胞苷酸，三磷酸腺苷和六偏磷酸鈉為原料，5’-胞苷酸和三磷酸腺苷容易采購、且相對(duì)廉價(jià)，用5’-胞苷酸激酶，多聚磷酸激酶與5’-胞苷酸，三磷酸腺苷和六偏磷酸鈉進(jìn)行一鍋催化反應(yīng)，合成得到胞苷-5’-二磷酸，使用5’-胞苷酸激酶，多聚磷酸激酶能夠減少副產(chǎn)物的生成。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，5’-胞苷酸激酶的DNA序列為SEQ?ID?NO:1所示，多聚磷酸激酶的DNA序列為SEQ?ID?NO:3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，5’-胞苷酸激酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2所示，多聚磷酸激酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，所述5’-胞苷酸激酶和所述多聚磷酸激酶分別克隆到外源載體上，所述外源載體上有相對(duì)應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，所述5’-胞苷酸激酶，多聚磷酸激酶為固定化酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，所述固定化酶經(jīng)過一步親和純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，所述固定化酶來源于微生物菌體過表達(dá)，優(yōu)先為大腸桿菌，酵
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，把所述5’-胞苷酸激酶和所述多聚磷酸激酶經(jīng)過同步純化和固定化后在與5’-胞苷，三磷酸腺苷和六偏磷酸鈉進(jìn)行一鍋催化反應(yīng)；
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，所述步驟二中的反應(yīng)溫度為37℃，所述步驟三中的反應(yīng)溫度為35℃，所述步驟三的反應(yīng)體系PH為α，所述α的范圍：7.0≤α≤8.0。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，5’-胞苷酸激酶的dna序列為seq?id?no:1所示，多聚磷酸激酶的dna序列為seq?id?no:3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，5’-胞苷酸激酶的氨基酸序列為seq?id?no:2所示，多聚磷酸激酶的氨基酸序列為seq?id?no:4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，所述5’-胞苷酸激酶和所述多聚磷酸激酶分別克隆到外源載體上，所述外源載體上有相對(duì)應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞苷-5’-二磷酸的制備方法，其特征在于，所述5...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃兵兵，高鑫，黃佳巧，余平平，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海日冠生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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