【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥領域，具體涉及一種融合蛋白、含其的高密度脂蛋白和仿生納米藥物及其制備和應用。
技術介紹
1、在常見的中樞神經系統疾病中，創傷性顱腦損傷（traumatic?brain?injury，tbi）的發病率高居首位。導致tbi患者神經功能障礙的主要原因為神經元大量損害及丟失引起高級神經活動和學習記憶能力缺失。在病理條件下，內源性神經營養因子的神經保護功能受損及其在腦損傷病灶的消耗殆盡是腦損傷后神經再生缺乏內在動力的關鍵。因此，如何高效靶向遞送神經營養因子促進神經再生修復是改善中樞神經系統損傷患者神經功能預后的關鍵。
2、目前，臨床上尚無神經營養因子相關藥物應用于中樞神經系統損傷的治療，尚無有效藥物用于中樞神經系統神經再生修復治療，在市場中，尚無相應的用于神經營養因子腦內遞送的有效載體。目前已申請并公開的專利主要為神經營養因子的載帶及其應用于體外或者外周神經損傷模型中，如cn103656623a制備載有神經營養因子的納米微球通過緩釋的形式能夠有效促進細胞軸突生長。cn111297513a公開了一種負載營養因子的人工神經導管，其特征是由外部的?；被嗵枪芎凸軆忍畛涞呢撦d神經營養因子緩釋層的生物纖維組成。cn116459329a制備了一種促進神經血管重建的納米復合材料及其制備方法和應用，但是由于缺乏靶向性，需要采取原位給藥的方法。
技術實現思路
1、為了解決現有中樞神經系統神經再生修復藥物存在的缺乏靶向性的問題，本專利技術提供了一種融合蛋白、含其的高密度脂蛋
2、本專利技術基于仿生原理模擬神經營養因子天然存在微環境，采用細胞基質組分透明質酸和魚精蛋白，與神經營養因子自組裝形成仿生核心，類細胞基質的仿生核心模仿天然神經營養因子儲存環境有效保護神經營養因子的生物活性并實現神經營養因子的普適性載帶。進而構建重組高密度脂蛋白（reconstituted?high?density?lipoprotein,?rhdl）外殼，與仿生核心通過靜電、氫鍵等作用自組裝形成核殼結構，保護神經營養因子的穩定性并實現其體內長循環。同時，結合神經靶向肽rvg，采用α螺旋肽融合技術在rhdl表面修飾神經靶向肽rvg，構建一種載帶神經營養因子的仿生載體，實現神經營養因子在腦內損傷病灶的高效靶向遞釋，促進神經再生修復。該仿生納米載體的設計突破神經營養因子腦內遞送瓶頸，為tbi及其他腦部疾病的神經再生修復治療提供新思路。
3、本專利技術第一方面提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包含α-螺旋雙親性多肽和神經元靶向肽。
4、在本專利技術的一些優選實施方案中，所述α-螺旋雙親性多肽選自apoa-ii、apoc-iii、apoe和apoa-1中的一種或多種；所述神經元靶向肽為rvg和/或所述rvg的模擬肽。
5、在本專利技術中，所述rvg的模擬肽指從狂犬病病毒糖蛋白（rvg）中衍生出的多肽片段，這些片段具有高度的嗜神經性，能夠特異性地識別并結合中樞神經系統中的煙堿型乙酰膽堿受體，并通過受體介導的轉胞吞機制穿透血腦屏障，將藥物或其他治療分子直接遞送到腦實質中。
6、在本專利技術的一些更優選實施方案中，所述α-螺旋雙親性多肽為apoa-1；所述神經元靶向肽為rvg；其中，所述apoa-1的氨基酸序列如seq?id?no:?3所示或與如seq?id?no:?3所示的氨基酸序列具有75%、80%、85%、90%、95%或99%的同一性；所述rvg靶向肽的氨基酸序列如seq?id?no:?4所示或與如seq?id?no:?4所示的氨基酸序列具有75%、80%、85%、90%、95%或99%的同一性。
7、在本專利技術的一些實施方案中，所述α-螺旋雙親性多肽和神經元靶向肽之間通過連接序列或連接片段相連。
8、在本專利技術的一些優選實施方案中，所述連接序列選自ggggs、gsl、gsgs、gsg和ggg中的任意一種或多種；所述連接片段包括(peg)n，其中，n為6-12的整數，例如，6、8、9或12。
9、在本專利技術的一些更優選實施方案中，所述連接序列為ggg；所述連接片段為(peg)n；其中，n為6-12的整數，例如，6、8、9或12。
10、在本專利技術的具體實施方案中，所述連接片段為peg12。
11、在本專利技術的一些實施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:?1或seqid?no:?2所示。
12、本專利技術第二方面提供了一種重組高密度脂蛋白，所述重組高密度脂蛋白包含脂質體、載脂蛋白和如本專利技術第一方面所述的融合蛋白；
13、在本專利技術的一些優選實施方案中，所述脂質體的脂質選自dmpc（二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿）、dope（二油酰磷脂酰乙醇胺）、dotap（(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨）、dopa（二油酰磷脂酸）、dmpa（二肉豆蔻酰磷脂酸鈉鹽）、dppa（二棕櫚酰磷脂酸）、dspa（二硬脂酰磷脂酸鈉鹽）和dops（二油?；字＝z氨酸）中的一種或多種；所述載脂蛋白選自apoe3、apoa-1和apoj中的一種或多種。
14、在本專利技術的具體實施方案中，所述脂質為dmpc和/或dopa，例如為dmpc和dopa，或dotap和dopa；所述載脂蛋白為apoe3。
15、在本專利技術的一些進一步更優選實施方案中，dmpc和dopa的摩爾比為0.5-5:1；dotap和dopa的摩爾比為0.5-5:1。
16、在本專利技術的具體實施方案中，dmpc和dopa的摩爾比為1.5:1；dotap和dopa的摩爾比為1.5:1。
17、在本專利技術中，所述載脂蛋白和如本專利技術第一方面所述的融合蛋白通過α螺旋結構鑲嵌并附著在所述脂質體表面。
18、本專利技術第三方面提供了一種制備重組高密度脂蛋白的方法，所述方法包括：（1）將所述脂質體和載脂蛋白經混合后進行共孵育獲得脂蛋白；
19、（2）將所述脂蛋白與如本專利技術第一方面所述的融合蛋白共孵育獲得所述重組高密度脂蛋白。
20、在本專利技術的一些實施方案中，所述脂質體通過所述脂質經薄膜水化法制得；所述脂質體的脂質選自dmpc、dope、dotap、dopa、dmpa、dppa、dspa和dops中的一種或多種；所述載脂蛋白選自apoe3、apoa-1和apoj中的一種或多種；所述共孵育滿足以下一種或多種條件：100-200?rpm，例如120?rpm；30-37℃，例如37oc；18-30?h，例如24?h。
21、在本專利技術的一些優選實施方案中，所述脂質為dmpc和/或dopa，例如為dmpc和dopa，或dotap和dopa；所述載脂蛋白為apoe3。
22、在本專利技術的具體實施方案中，所述脂質體、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含α-螺旋雙親性多肽和神經元靶向肽；所述α-螺旋雙親性多肽為ApoA-1；所述神經元靶向肽為RVG；其中，所述ApoA-1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:?3所示；所述RVG靶向肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:?4所示；所述α-螺旋雙親性多肽和神經元靶向肽之間通過連接序列或連接片段相連；所述連接序列為GGG；所述連接片段為PEG12。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?IDNO:?1或SEQ?ID?NO:?2所示。
3.一種重組高密度脂蛋白，其特征在于，所述重組高密度脂蛋白包含脂質體、載脂蛋白和如權利要求1或2所述的融合蛋白；
4.如權利要求3所述的重組高密度脂蛋白，其特征在于，DMPC和DOPA的摩爾比為(0.5-5):1。
5.一種制備重組高密度脂蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）將脂質體和載脂蛋白經混合后進行共孵育獲得脂蛋白；所述脂質體的脂質為DMPC和DOPA；所述載脂蛋白選自ApoE3、ApoA-1和ApoJ中的一種或多
6.?如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：所述脂質體通過所述脂質經薄膜水化法制得；所述共孵育滿足以下一種或多種條件：100-200?rpm；30-37℃；18-30h。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂質體、載脂蛋白和融合蛋白的摩爾比為(1000-2000):(1-100):1；DMPC和DOPA的摩爾比為(0.5-5):1。
8.一種重組高密度脂蛋白，其特征在于，所述重組高密度脂蛋白由如權利要求5-7任一項所述的方法制備獲得。
9.一種仿生納米藥物，其特征在于，所述仿生納米藥物為核殼結構，由內向外依次包含藥物納米凝膠和重組高密度脂蛋白；其中，所述重組高密度脂蛋白包含如權利要求3、4或8所述的重組高密度脂蛋白。
10.如權利要求9所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述重組高密度脂蛋白作為外殼包裹在所述藥物納米凝膠的外層。
11.如權利要求9所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述藥物納米凝膠包含透明質酸、魚精蛋白和藥物；所述藥物為生物大分子藥物。
12.如權利要求11所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述生物大分子藥物為蛋白質藥物和/或核酸藥物。
13.如權利要求12所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述蛋白質藥物包括選自干擾素、細胞因子、蛋白類激素、多肽、抗體和疫苗中的一種或多種；所述核酸藥物包括選自核苷酸藥物、核酸藥物及含有不同堿基化合物的藥物中的一種或多種。
14.一種制備仿生納米藥物的方法，其特征在于，所述方法包括：將載有藥物納米凝膠的脂質體與載脂蛋白經混合共孵育后與如權利要求1或2所述的融合蛋白共孵育；所述脂質體的脂質為DMPC和DOPA；所述載脂蛋白選自ApoE3、ApoA-1和ApoJ中的一種或多種。
15.?如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述共孵育滿足以下一種或多種條件：100-200?rpm；30-37℃；18-30?h。
16.?如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：將所述藥物納米凝膠與所述脂質體于20-25℃共孵育15-40?min獲得載有所述藥物納米凝膠的脂質體。
17.?如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：由藥物、透明質酸和魚精蛋白于20-25℃共孵育5-15?min獲得所述藥物納米凝膠；所述藥物為生物大分子藥物。
18.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：將脂質通過薄膜水化法制得脂質體。
19.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物大分子藥物為蛋白質藥物和/或核酸藥物。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白質藥物包括選自干擾素、細胞因子、蛋白類激素、多肽、抗體和疫苗中的一種或多種；所述核酸藥物包括選自核苷酸藥物、核酸藥物及含有不同堿基化合物的藥物中的一種或多種。
21.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述脂質體、載脂蛋白和融合蛋白的摩爾比為(1000-2000):(1-100):1；DMPC和DOPA的摩爾比為(0.5-5):1；所述藥物、透明質酸和魚精蛋白的摩爾比為(400-800):(2-8):(50-100)。
22.一種仿生納米藥物，其特征在于，所述仿生納米藥物由如權利要求14-21任一項所述的方法制備獲得。
23.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含如權利要求1或2所述的融...
【技術特征摘要】
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含α-螺旋雙親性多肽和神經元靶向肽；所述α-螺旋雙親性多肽為apoa-1；所述神經元靶向肽為rvg；其中，所述apoa-1的氨基酸序列如seq?id?no:?3所示；所述rvg靶向肽的氨基酸序列如seq?id?no:?4所示；所述α-螺旋雙親性多肽和神經元靶向肽之間通過連接序列或連接片段相連；所述連接序列為ggg；所述連接片段為peg12。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq?idno:?1或seq?id?no:?2所示。
3.一種重組高密度脂蛋白，其特征在于，所述重組高密度脂蛋白包含脂質體、載脂蛋白和如權利要求1或2所述的融合蛋白；
4.如權利要求3所述的重組高密度脂蛋白，其特征在于，dmpc和dopa的摩爾比為(0.5-5):1。
5.一種制備重組高密度脂蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）將脂質體和載脂蛋白經混合后進行共孵育獲得脂蛋白；所述脂質體的脂質為dmpc和dopa；所述載脂蛋白選自apoe3、apoa-1和apoj中的一種或多種；
6.?如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：所述脂質體通過所述脂質經薄膜水化法制得；所述共孵育滿足以下一種或多種條件：100-200?rpm；30-37℃；18-30h。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂質體、載脂蛋白和融合蛋白的摩爾比為(1000-2000):(1-100):1；dmpc和dopa的摩爾比為(0.5-5):1。
8.一種重組高密度脂蛋白，其特征在于，所述重組高密度脂蛋白由如權利要求5-7任一項所述的方法制備獲得。
9.一種仿生納米藥物，其特征在于，所述仿生納米藥物為核殼結構，由內向外依次包含藥物納米凝膠和重組高密度脂蛋白；其中，所述重組高密度脂蛋白包含如權利要求3、4或8所述的重組高密度脂蛋白。
10.如權利要求9所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述重組高密度脂蛋白作為外殼包裹在所述藥物納米凝膠的外層。
11.如權利要求9所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述藥物納米凝膠包含透明質酸、魚精蛋白和藥物；所述藥物為生物大分子藥物。
12.如權利要求11所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述生物大分子藥物為蛋白質藥物和/或核酸藥物。
13.如權利要求12所述的仿生納米藥物，其特征在于，所述蛋白質藥物包括選自干擾素、細胞因子、蛋白類激素、多肽、抗體和疫苗中的一種或多種；所述核酸藥物包括選自...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃佳琳，馮軍峰，高小玲，彭亦東，翁維吉，
申請(專利權)人：上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，
類型：發明
國別省市：
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