【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基于雙鏈dna脫氨酶的融合蛋白及表觀遺傳學修飾檢測方法。
技術介紹
1、轉錄因子、染色質相關蛋白和組蛋白修飾在基因調控和表觀遺傳學研究中扮演著關鍵角色，它們協同調控基因的開啟或關閉狀態。轉錄因子結合特定的dna序列，促進或抑制相關基因的轉錄，同時染色質的開放度及組蛋白修飾狀態影響特定基因組區域的開放性，從而控制基因組的功能狀態?。例如，乙酰化、甲基化、泛素化等不同的組蛋白修飾能夠調節染色質的緊密程度和基因轉錄水平，影響基因表達的水平?。近年來，隨著高通量技術的發展，出現了多種技術來檢測能夠轉錄因子、染色質相關蛋白和組蛋白修飾在基因組上的定位。
2、染色質免疫共沉淀技術(chromatin?immunoprecipitation,?chip)是一種用于研究蛋白質與dna相互作用的經典方法，可揭示轉錄因子結合位點及組蛋白修飾特性?。2007年，chip技術與高通量二代測序相結合，形成了染色質免疫共沉淀測序技術(chip-seq)，這一技術顯著推動了表觀遺傳學與基因調控研究的發展?。chip-seq通過甲醛固定細胞或組織，裂解后隨機打斷染色質，將目標蛋白-dna復合物通過特異性抗體沉淀，隨后反交聯提取dna并進行測序。測序數據可用于識別全基因組范圍內的蛋白結合位點，為研究基因調控提供了關鍵信息。然而，chip-seq的應用受限于高樣本需求、信噪比有限以及對抗體質量的高度依賴?。
3、近年來，研究人員相繼開發了cut&run(cleavage?under?targets?and?releas
4、此外，近年來發展的一些新技術進一步擴展了研究的可能性。2022年，定向甲基化與長讀長測序技術(dimelo-seq)通過將n6腺嘌呤甲基轉移酶與protein?a融合，在目標蛋白結合位點附近進行6ma甲基化，并結合納米孔測序或pacbio?hifi測序檢測dna分子上蛋白-dna相互作用?。dimelo-seq的無擴增策略盡管具有高精度與長讀長優勢，但為了保留甲基化信息，其dna樣本不能擴增，對起始材料的需求較高(100-200萬細胞/實驗)，限制了其在稀有樣本中的應用。
5、cut&tag，cut&run與dimelo-seq均利用了protein?a蛋白結合抗體fc段，實現將酶與抗體的結合。但是protein?a對不同物種來源的抗體存在親和力差異，如對兔源抗體親和力很強，但是對鼠源抗體親和力很弱。在相關技術的持續發展中，出現了兩種不同的技術路線。一種路線是nano-ct，它將cut&tag中的protein?a進一步替換成特異性更強的納米抗體，識別特定物種的抗體fc段?。另一種則是將protein?a與protein?g融合表達，通過聯用的方式達到對不同種屬抗體更為普遍性的親和力?。
6、雙鏈dna脫氨酶的發現為基因組研究提供了新的工具。與單鏈dna脫氨酶不同，ddda等雙鏈dna脫氨酶能夠在雙鏈dna中催化胞嘧啶脫氨反應，將胞嘧啶轉化為尿嘧啶。2020年，joseph?mougous與david?liu課題組首次報道了雙鏈脫氨酶ddda與talen融合開發了ddcbe，實現了線粒體基因組的單堿基精準編輯，為線粒體遺傳病研究提供了重要工具。joseph?mougous課題組隨后建立了3d-seq技術，通過將ddda與特定轉錄因子在尿嘧啶耐受型(ung基因敲除)的活細菌中的融合過表達，使該轉錄因子基因組結合位點附近的將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，隨后在pcr擴增和下一代測序過程中檢測尿嘧啶為胸腺嘧啶，以此判斷該轉錄因子的定位?。然而，ddda在活細胞中有較高毒性，僅能用于尿嘧啶耐受型的細菌(ung基因敲除)，并且每次檢測都需要與特定轉錄因子融合表達，限制了它的通量，以及在真核細胞中的應用。
技術實現思路
1、為了克服現有技術的上述缺陷，本專利技術人開發了一種基于靶向性雙鏈dna脫氨酶來檢測染色質相關蛋白質與dna相互作用的方法。本專利技術人將對抗體具有特異性親和力的protein?a和protein?g與雙鏈dna脫氨酶融合表達，所述抗體對染色質相關蛋白或染色質相關蛋白修飾具有特異性親和力，利用protein?a-protein?g蛋白結合抗體的特性，將雙鏈dna脫氨酶引導到特定染色質相關蛋白質或染色質相關蛋白修飾與dna結合的位置，通過雙鏈dna脫氨酶對該處dna脫氨，從而實現了染色質相關蛋白或染色質相關蛋白修飾在雙鏈dna序列上的定位。這一過程不僅提供了更精準的修飾檢測手段，而且避免了常見的修飾檢測方法中可能存在的dna片段化問題，使得成為一種理想的dna結合蛋白檢測技術。本專利技術的這一檢測方法命名為andie（antibody-associated?deaminase）。
2、為實現上述目的，本專利技術在第一方面提供一種融合蛋白，所述融合蛋白從n末端至c末端包含：對抗體具有特異性親和力的分子、連接肽和雙鏈dna脫氨酶，其中，所述對抗體具有特異性親和力的分子是protein?a和/或protein?g，并且所述抗體是對染色質相關蛋白或染色質相關蛋白修飾具有特異性親和力的抗體。
3、在本專利技術第一方面的一個實施方式中，雙鏈dna脫氨酶是雙鏈dna脫氨酶的活性結構域dddatox。
4、在本專利技術第一方面的一個實施方式中，protein?a序列為seq?id?no.?1；proteing蛋白序列為seq?id?no.?2；連接肽序列為seq?id?no.?3；和/或雙鏈dna脫氨酶序列為seqid?no.?4。
5、在本專利技術第一方面的一個實施方式中，所述染色質相關蛋白是選自dna結合蛋白、轉錄因子和組蛋白中的至少一種蛋白，或與dna結合蛋白、轉錄因子和組蛋白中的至少一種蛋白結合的蛋白。
6、本專利技術還提供了一種多核苷酸，其編碼以上所述的本專利技術的融合蛋白。
7、本專利技術還提供了一種核酸載體，其包含以上所述的本專利技術的多核苷酸。
8、專利技術還提供了一種宿主細胞，其包含以上所述的本專利技術的多核苷酸或以上所述的本專利技術的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白從N末端至C末端包含：對抗體具有特異性親和力的分子、連接肽和雙鏈DNA脫氨酶，其中，所述對抗體具有特異性親和力的分子是Protein?A和/或Protein?G，并且所述抗體是對染色質相關蛋白或染色質相關蛋白修飾具有特異性親和力的抗體。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，所述染色質相關蛋白是選自DNA結合蛋白、轉錄因子和組蛋白中的至少一種蛋白，或與選自DNA結合蛋白、轉錄因子和組蛋白中的至少一種蛋白結合的蛋白。
4.一種多核苷酸，其編碼權利要求1至3中任一項所述的融合蛋白。
5.一種核酸載體，其包含權利要求4所述的多核苷酸。
6.一種宿主細胞，其包含權利要求4所述的多核苷酸或權利要求5所述的核酸載體。
7.一種檢測染色質相關蛋白或染色質相關蛋白修飾在雙鏈DNA序列上的位置的方法，所述方法包括：
8.根據權利要求7所述的方法，所述雙鏈DNA脫氨酶指能使雙鏈DNA上胞嘧啶和/或腺嘌呤發生脫氨反應的酶或其脫氨酶結構域。
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