【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及抗體檢測(cè)，尤其涉及一種犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡及其制備方法和試劑盒。
技術(shù)介紹
1、?蟲(chóng)媒病是一類(lèi)以節(jié)肢動(dòng)物為傳播媒介的傳染病，蟲(chóng)媒生物種類(lèi)繁多，分布情況復(fù)雜，有蚊媒、蜱媒、螨、虱媒和蚤媒等，通過(guò)叮咬方式傳播給動(dòng)物及人類(lèi)宿主。其中，嚴(yán)重影響犬類(lèi)健康的主要包括埃立克體病（ehrlichia?canis）、無(wú)形體病（ana）、巴貝斯蟲(chóng)病（babesia）、萊姆病（lyme）以及利什曼原蟲(chóng)病（lsh）。蟲(chóng)媒病具有嚴(yán)重的傳染性和破壞性，尤其這類(lèi)昆蟲(chóng)具有強(qiáng)大的適應(yīng)力和生存力，通常躲在草叢、灌木叢等隱蔽處，當(dāng)寵物犬不經(jīng)意間經(jīng)過(guò)這些區(qū)域，蟲(chóng)類(lèi)便會(huì)迅速附著在它們的身上，吸血并傳染疾病。
2、大部分被叮咬后的犬類(lèi)，初期往往不會(huì)表現(xiàn)出明顯癥狀，幾周甚至幾個(gè)月后，病癥才會(huì)逐漸顯現(xiàn)。加之由于蟲(chóng)媒生物種類(lèi)繁多，分布情況多樣復(fù)雜，且蟲(chóng)媒傳染病遠(yuǎn)距離傳播的情況越來(lái)越普遍，臨床發(fā)病癥狀也非常相似。因此，在蟲(chóng)媒病高發(fā)季節(jié)，對(duì)于犬類(lèi)表現(xiàn)出的身體異常，可使用高特異性和靈敏度的犬類(lèi)蟲(chóng)媒病igg和igm抗體檢測(cè)卡進(jìn)行初步篩查，判斷其當(dāng)前或曾經(jīng)是否存在感染，有助于寵物醫(yī)生對(duì)癥治療。
3、但多種蟲(chóng)媒病igg和igm抗體聯(lián)合檢測(cè)既要求所使用的不同蟲(chóng)媒病抗原與相應(yīng)igg和igm之間有較好的結(jié)合性能，以實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)，又要求各抗原與相應(yīng)igg和igm之間的結(jié)合具有較高的特異性，以避免不同蟲(chóng)媒病igg和igm抗體的檢測(cè)相互干擾，因而具有較高的設(shè)計(jì)難度。而目前尚未報(bào)道過(guò)可用于犬類(lèi)常見(jiàn)的5種蟲(chóng)媒病（埃立克體病、無(wú)形體病、巴貝斯蟲(chóng)病、萊姆病以及利什曼
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡及其制備方法和試劑盒。該檢測(cè)卡和試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)犬埃立克體病、犬無(wú)形體病、犬類(lèi)巴貝斯蟲(chóng)病、犬萊姆病和犬利什曼原蟲(chóng)病對(duì)應(yīng)的igg和igm抗體的聯(lián)合檢測(cè)，并具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異性。
2、本專(zhuān)利技術(shù)的具體技術(shù)方案為：
3、第一方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，包括以下a）~e）5種檢測(cè)抗原：
4、a）利什曼原蟲(chóng)抗原：為rk39、rk26和rk9的融合蛋白；
5、b）巴貝斯蟲(chóng)抗原：為trap和rbcmsa1/rbcsa1的融合蛋白；
6、c）無(wú)形體抗原：為p44和omp-1x的融合蛋白；
7、d）埃立克體抗原：為gp19蛋白；
8、e）萊姆抗原：為伯氏疏螺旋體ospc外膜蛋白。
9、在本專(zhuān)利技術(shù)中，所述及的“rbcmsa1/rbcsa1”是指rbcmsa1和rbcsa1的融合蛋白。
10、?在利什曼原蟲(chóng)病對(duì)應(yīng)igg和igm抗體的檢測(cè)中，當(dāng)僅采用rk39蛋白時(shí)，會(huì)對(duì)巴西和印度部分患犬利什曼原蟲(chóng)病的犬類(lèi)存在漏檢情況，采用rk39、rk26和rk9的融合蛋白，可解決上述問(wèn)題，提高利什曼原蟲(chóng)病的檢出率，減少假陰性的情況。感染犬類(lèi)的巴貝斯蟲(chóng)常見(jiàn)亞型是小巴貝斯蟲(chóng)即吉氏巴貝斯蟲(chóng)（babesia?gibsoni）和大巴貝斯蟲(chóng)即犬巴貝斯蟲(chóng)（babesiacanis），在巴貝斯蟲(chóng)病對(duì)應(yīng)igg和igm抗體的檢測(cè)中采用trap和rbcmsa1/rbcsa1的融合蛋白，能夠兼顧上述兩個(gè)巴貝斯蟲(chóng)亞型的檢測(cè)，提高巴貝斯蟲(chóng)的檢出率。犬無(wú)形體包括嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體（anaplasma?phogocytophilum）和扁平無(wú)形體（anaplasma?platys）兩個(gè)亞型，在無(wú)形體病對(duì)應(yīng)igg和igm抗體的檢測(cè)中采用p44和omp-1x的融合蛋白，能夠使上述兩個(gè)犬無(wú)形體亞型均可被檢出。
11、并且，檢測(cè)抗原的設(shè)計(jì)會(huì)影響檢測(cè)靈敏度。在本專(zhuān)利技術(shù)所使用的三種融合蛋白中，通過(guò)選用特定的單體蛋白相配合，在構(gòu)成的融合蛋白后仍能與對(duì)應(yīng)的犬蟲(chóng)媒病抗體之間具有較好的結(jié)合性能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)較高的檢測(cè)靈敏度，有助于提高檢出率，減少假陰性的情況。
12、此外，igm抗體主要在感染初期產(chǎn)生，igg抗體主要產(chǎn)生于感染后相對(duì)較晚的時(shí)期，抗igg抗體和抗igm抗體不同區(qū)段的特異性差別很大。本專(zhuān)利技術(shù)所采用的5種檢測(cè)抗原能夠兼顧5種犬蟲(chóng)媒病igm和igg抗體的檢測(cè)，使igm和igg均能被檢出，且對(duì)各犬蟲(chóng)媒病的igm和igg抗體均具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異性，因而有助于實(shí)現(xiàn)較高的檢測(cè)準(zhǔn)確性。
13、作為優(yōu)選，所述犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡包括5個(gè)試劑條；每個(gè)所述試劑條包括底板以及在底板上依次疊加的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；5個(gè)試劑條的金標(biāo)結(jié)合墊上分別包被有所述5種檢測(cè)抗原與膠體金的偶聯(lián)物，硝酸纖維素膜上均設(shè)有包被有抗犬igg抗體和抗犬igm抗體的檢測(cè)線。
14、作為優(yōu)選，5個(gè)試劑條的硝酸纖維素膜上均設(shè)有分別包被有抗犬igg抗體和抗犬igm抗體的2條檢測(cè)線。
15、通過(guò)設(shè)置上述2條檢測(cè)線，能夠區(qū)分igg和igm抗體的檢測(cè)，從而更為直觀地判斷犬類(lèi)是近期感染還是曾經(jīng)感染，便于寵物醫(yī)生快速采取有針對(duì)性地治療，減少傳播風(fēng)險(xiǎn)。
16、?以利什曼原蟲(chóng)病（lsh）為例，其試紙條的檢測(cè)原理如下：金標(biāo)結(jié)合墊上包被有利什曼原蟲(chóng)抗原與膠體金的偶聯(lián)物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“金標(biāo)lsh抗原”），該偶聯(lián)物呈紫紅色。當(dāng)待測(cè)樣本中含lsh相應(yīng)的igg或igm抗體時(shí)，該抗體能夠與金標(biāo)結(jié)合墊上的金標(biāo)lsh抗原特異性結(jié)合，形成金標(biāo)lsh抗原-lsh?igg或igm抗體復(fù)合物。以硝酸纖維素膜為載體，上述復(fù)合物通過(guò)毛細(xì)管層析作用擴(kuò)散移動(dòng)。當(dāng)待測(cè)樣本中含有l(wèi)sh相應(yīng)的igg抗體時(shí)，金標(biāo)lsh抗原-lsh?igg抗體復(fù)合物與包被在硝酸纖維素膜上的抗犬igg抗體結(jié)合，在其對(duì)應(yīng)的檢測(cè)線上顯示出紫紅色條帶，表明lsh?igg抗體陽(yáng)性；當(dāng)待測(cè)樣本中不含有l(wèi)sh相應(yīng)的igg抗體時(shí)，包被有抗犬igg抗體的檢測(cè)線上不顯色，表明lsh?igg抗體陰性。同理，當(dāng)待測(cè)樣本中含有l(wèi)sh相應(yīng)的igm抗體時(shí)，包被有抗犬igm抗體的檢測(cè)線上顯示出紫紅色條帶，表明lsh?igm抗體陽(yáng)性；當(dāng)待測(cè)樣本中不含有l(wèi)sh相應(yīng)的igm抗體時(shí)，包被有抗犬igm抗體的檢測(cè)線上不顯色，表明lsh?igm抗體陰性。
17、埃立克體病、無(wú)形體病、巴貝斯蟲(chóng)病和萊姆病的檢測(cè)原理與上述利什曼原蟲(chóng)病的檢測(cè)原理相同。
18、進(jìn)一步地，所述抗犬igg抗體為兔抗犬igg抗體和/或鼠抗犬igg抗體；所述抗犬igm抗體為兔抗犬igm抗體和/或鼠抗犬igm抗體。
19、作為優(yōu)選，5個(gè)試劑條的金標(biāo)結(jié)合墊均包被有雞igy與膠體金的偶聯(lián)物，硝酸纖維素膜上均設(shè)有包被有抗雞igy抗體的質(zhì)控線。
20、?雞igy其結(jié)構(gòu)的fc區(qū)段不與哺乳動(dòng)物的fc受體、補(bǔ)體、類(lèi)風(fēng)濕因子、protein?a、protein?g和protein?l發(fā)生相互作用，與犬類(lèi)二抗（如兔抗犬igg/igm、鼠抗犬igg/igm）種系發(fā)生距離相差更大，與igg和igm幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)，因此，采用雞igy作為質(zhì)控，可以避免與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白之間結(jié)合所帶來(lái)的顯著干擾，減少假陽(yáng)性的發(fā)生。...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，包括以下a）~e）5種檢測(cè)抗原：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，包括5個(gè)試劑條；每個(gè)所述試劑條包括底板以及在底板上依次疊加的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；5個(gè)試劑條的金標(biāo)結(jié)合墊上分別包被有所述5種檢測(cè)抗原與膠體金的偶聯(lián)物，硝酸纖維素膜上均設(shè)有包被有抗犬IgG抗體和抗犬IgM抗體的檢測(cè)線。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，5個(gè)試劑條的硝酸纖維素膜上均設(shè)有分別包被有抗犬IgG抗體和抗犬IgM抗體的2條檢測(cè)線。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，5個(gè)試劑條的金標(biāo)結(jié)合墊均包被有雞IgY與膠體金的偶聯(lián)物，硝酸纖維素膜上均設(shè)有包被有抗雞IgY抗體的質(zhì)控線。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，所述樣品墊與金標(biāo)結(jié)合墊之間設(shè)有濾血膜。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求2~5之一所述犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，
8.一種犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求1~5之一所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述緩沖液的pH為7.2~7.8，包括以下濃度的組分：4~6g/L?NaCl，10~12g/L?EDTA，6~7g/L酪蛋白，20~30mmol/L?4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.01~0.05wt%抑菌劑。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，包括以下a）~e）5種檢測(cè)抗原：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，包括5個(gè)試劑條；每個(gè)所述試劑條包括底板以及在底板上依次疊加的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；5個(gè)試劑條的金標(biāo)結(jié)合墊上分別包被有所述5種檢測(cè)抗原與膠體金的偶聯(lián)物，硝酸纖維素膜上均設(shè)有包被有抗犬igg抗體和抗犬igm抗體的檢測(cè)線。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，5個(gè)試劑條的硝酸纖維素膜上均設(shè)有分別包被有抗犬igg抗體和抗犬igm抗體的2條檢測(cè)線。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，5個(gè)試劑條的金標(biāo)結(jié)合墊均包被有雞igy與膠體金的偶聯(lián)物，硝酸纖維素膜上均設(shè)有包被有抗雞igy抗體的質(zhì)控線。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡，其特征在于，所述樣品墊與金標(biāo)結(jié)合墊之間設(shè)有濾血膜。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求2~5之一所述犬蟲(chóng)媒病五聯(lián)抗體檢測(cè)卡的制備方法，...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高萌，孫曉笛，張秋雪，陳金樹(shù)，陸維克，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：杭州奧泰生物技術(shù)股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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