【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)適用于植物保護(hù)，涉及一種基于gsh-dtnb顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑代謝活性的方法，用于快速檢測植物谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)不同除草劑的代謝效率。
技術(shù)介紹
1、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶（glutathione?s-transferase,?gst）催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)，參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及對(duì)外源有害化合物的解毒代謝等生理活動(dòng)。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)多種植物gst基因家族進(jìn)行了全基因組水平鑒定與注釋分析，加快了gst基因的定位和成員分類等研究。例如，jain和sappl等人對(duì)擬南芥、水稻和毛楊這三種植物中的gst基因進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定和注釋，揭示了不同植物中g(shù)st成員的多樣性，擬南芥中有53個(gè)gst成員，水稻中有79個(gè)，而毛楊中則多達(dá)81個(gè)；這種多樣性反映了gst基因家族在植物進(jìn)化過程中的擴(kuò)張和適應(yīng)不同環(huán)境的能力。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在亞家族分類上，植物具有4個(gè)特殊的gst類別：phi（f）,?tau（u），脫氫抗壞血酸還原酶（dhar）和lambda（l）。同一個(gè)亞家族的gst成員通常在基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有較高的保守性，有利于對(duì)家族成員進(jìn)行識(shí)別、分類、模型構(gòu)建和活性預(yù)測。目前為止，盡管已有不同植物的大量gst成員被鑒定并注釋，但其中只有少數(shù)成員的功能被詳細(xì)解析。
2、pelon等人發(fā)現(xiàn)gst基因家族中phi（f）和tau（u）參與除草劑解毒代謝作用，其成員數(shù)量眾多，在雜草抗藥性和作物育種研究領(lǐng)域具有重要意義；它們通過催化谷胱甘肽（gsh）結(jié)合反應(yīng)直接有效地對(duì)除草
3、植物體中部分gst成員的代謝功能和作用機(jī)理已經(jīng)得到了較好的解析。prade等人展示了除草劑分子（fe-4053，阿特拉津）與解毒酶aragst（1bx9）或zmgsti（1bye）結(jié)合的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，為催化位點(diǎn)的深入解析提供了理想的晶體構(gòu)象。dücker等人利用同位素標(biāo)記法和液相串聯(lián)放射性檢測器，深入分析了氟噻草胺在iii相代謝中的分解作用，發(fā)現(xiàn)gst催化氟噻草胺代謝能夠顯著降低大穗看麥娘（alopecurus?myosuroides?huds.）和黑麥草（lolium?spp.）的敏感性，進(jìn)一步證實(shí)了gst在介導(dǎo)雜草抗藥性方面的重要作用。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，能夠在植物的各個(gè)生長發(fā)育階段準(zhǔn)確地解析gst基因家族成員的表達(dá)水平，這使得能夠挑選出具有差異性表達(dá)的gst成員進(jìn)行體外酶活反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，通過hplc-dad或液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)分析（lc-ms/ms）檢測，更深層次地了解gst催化代謝的情況及對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。然而，盡管這一研究流程能夠準(zhǔn)確地建立代謝酶與除草劑活性分子之間的代謝關(guān)聯(lián)，但整套檢測體系所需設(shè)備和耗材成本高昂，且檢測過程耗時(shí)長，效率相對(duì)較低。因此，亟需開發(fā)一種高通量檢測gst酶催化除草劑代謝的分析方法，以加速對(duì)植物gst基因功能的研究。
4、dtnb全稱是5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5'-dithiobis-（2-nitrobenzoicacid）），是一種為無色或淡黃色的粉末狀物質(zhì)，作為評(píng)估生物樣本中游離谷胱甘肽（gsh）含量的重要試劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和植物病理檢測領(lǐng)域。dtnb的顯色原理是基于二硫鍵（-s-s-）與巰基（-sh）之間的替換反應(yīng)，在常溫下即可與gsh快速反應(yīng)，釋放出一分子的gs-tnb和一分子的tnb2-。tnb2-在中性和弱堿性環(huán)境（ph=7.2~8.0）下相較穩(wěn)定，且在412?nm的光波長下具有最大吸收峰（14,150?m-1?cm-1），能夠通過酶標(biāo)儀在對(duì)應(yīng)光波長下進(jìn)行檢測。利用這一特性，在gst催化的除草劑代謝反應(yīng)體系中，引入dtnb對(duì)反應(yīng)剩余的游離gsh進(jìn)行結(jié)合，促使反應(yīng)快速終止；利用酶標(biāo)儀對(duì)反應(yīng)體系顯色情況進(jìn)行檢測，換算出除草劑分子的代謝量，進(jìn)而在一定條件下對(duì)植物gst成員進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地定性和定量功能分析。反應(yīng)從初始上樣到最終檢測整個(gè)流程可以兩個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，效率和成本顯著低于液相色譜-質(zhì)譜體系的分析方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種基于gsh-dtnb顯色反應(yīng)檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶gst對(duì)除草劑代謝能力的高通量酶活性測定方法。
2、本專利技術(shù)的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
3、第一方面，本專利技術(shù)請(qǐng)求保護(hù)一種基于gsh-dtnb顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶gst對(duì)除草劑代謝活性的檢測體系，該檢測體系包括反應(yīng)體系和空白對(duì)照體系，所述的反應(yīng)體系包含：純化谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶gst蛋白，除草劑溶液，反應(yīng)起始劑gsh溶液和反應(yīng)終止劑dtnb溶液；以等體積的純化洗脫液替代所述反應(yīng)體系中的純化gst蛋白作為空白對(duì)照體系。
4、進(jìn)一步上述的檢測體系中所述的反應(yīng)體系包含：189?μl?0.25?mg/ml純化gst蛋白，1?μl?50?mm除草劑溶液，以10?μl?5?mm?gsh溶液啟動(dòng)反應(yīng)，29-31℃黑暗孵育后，加入10μl?20?mm?dtnb溶液作為反應(yīng)終止劑；以189?μl純化洗脫液替代所述反應(yīng)體系中的純化gst蛋白作為空白對(duì)照。
5、更進(jìn)一步，前述的除草劑溶液以dmso作為溶劑，前述的gsh溶液以ddh2o作為溶劑，前述的dtnb溶液以dmso作為溶劑。前述的純化洗脫液為含50?mm咪唑，50?mm?nah2po4，300mm?nacl，ph=7.5的鹽溶液。
6、第二方面，本專利技術(shù)請(qǐng)求保護(hù)上述檢測體系中的試劑在制備高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑代謝活性的試劑盒中的應(yīng)用。
7、第三方面，本專利技術(shù)請(qǐng)求保護(hù)一種基于gsh-dtnb顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑代謝活性的試劑盒，該試劑盒中包含前述檢測體系中的試劑。
8、第四方面，本專利技術(shù)請(qǐng)求保護(hù)一種基于gsh-dtnb顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑代謝活性的方法，該方法為：取純化gst蛋白和除草劑溶液，以gsh溶液作為反應(yīng)起始劑啟動(dòng)反應(yīng)，黑暗孵育后，加入dtnb溶液作為反應(yīng)終止劑終止反應(yīng)得到反應(yīng)體系；以等體積的純化洗脫液替代所述反應(yīng)體系中的純化gst蛋白作為空白對(duì)照體系；檢測所述反應(yīng)體系和空白對(duì)照體系的a412吸光值，定量反應(yīng)體系和空白對(duì)照體系中的gsh濃度并計(jì)算谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑的代謝率。
9、代謝率計(jì)算公式如下：
10、除草劑代謝率（%）=（1-（反應(yīng)體系gsh殘留量）/（空白對(duì)照體系gsh殘留量））×100%
11、進(jìn)一步，上述的方法中，取189?μl?0.25?mg/ml純化gst蛋白和1?μl?50?mm除草劑溶液，以10本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于GSH-DTNB顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST對(duì)除草劑代謝活性的檢測體系，其特征在于，該檢測體系包括反應(yīng)體系和空白對(duì)照體系，所述的反應(yīng)體系包含：189?μL?0.25?mg/mL純化GST蛋白，1?μL?50?mM除草劑溶液，以10?μL?5?mM?GSH溶液啟動(dòng)反應(yīng)，29-31℃黑暗孵育后，加入10?μL?20?mM?DTNB溶液作為反應(yīng)終止劑；以189?μL純化洗脫液替代所述反應(yīng)體系中的純化GST蛋白作為空白對(duì)照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測體系，其特征在于，所述的除草劑溶液以DMSO作為溶劑，所述的GSH溶液以ddH2O作為溶劑，所述的DTNB溶液以DMSO作為溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測體系，其特征在于，所述的純化洗脫液為含50?mM咪唑，50mM?NaH2PO4，300?mM?NaCl，pH=7.5的鹽溶液。
4.權(quán)利要求1或2或3所述檢測體系中的試劑在制備高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑代謝活性的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種基于GSH-DTNB顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST對(duì)
6.一種基于GSH-DTNB顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST對(duì)除草劑代謝活性的方法，其特征在于，該方法為：取純化GST蛋白和除草劑溶液，以GSH溶液作為反應(yīng)起始劑啟動(dòng)反應(yīng)，黑暗孵育后，加入DTNB溶液作為反應(yīng)終止劑終止反應(yīng)得到反應(yīng)體系；以等體積的純化洗脫液替代所述反應(yīng)體系中的純化GST蛋白作為空白對(duì)照體系；檢測所述反應(yīng)體系和空白對(duì)照體系的A412吸光值，定量反應(yīng)體系和空白對(duì)照體系中的GSH濃度并計(jì)算谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑的代謝率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，取189?μL?0.25?mg/mL純化GST蛋白和1?μL50?mM除草劑溶液，以10?μL?5?mM?GSH溶液作為反應(yīng)起始劑啟動(dòng)反應(yīng)，29-31℃黑暗孵育后，加入10?μL?20?mM?DTNB溶液作為反應(yīng)終止劑終止反應(yīng)得到反應(yīng)體系；以189?μL純化洗脫液替代所述反應(yīng)體系中的純化GST蛋白作為空白對(duì)照體系。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的除草劑溶液以DMSO作為溶劑，所述的GSH溶液以ddH2O作為溶劑，所述的DTNB溶液以DMSO作為溶劑。
9.?根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的純化洗脫液為含50?mM咪唑，50mM?NaH2PO4，300?mM?NaCl，pH=7.5的鹽溶液。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于gsh-dtnb顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶gst對(duì)除草劑代謝活性的檢測體系，其特征在于，該檢測體系包括反應(yīng)體系和空白對(duì)照體系，所述的反應(yīng)體系包含：189?μl?0.25?mg/ml純化gst蛋白，1?μl?50?mm除草劑溶液，以10?μl?5?mm?gsh溶液啟動(dòng)反應(yīng)，29-31℃黑暗孵育后，加入10?μl?20?mm?dtnb溶液作為反應(yīng)終止劑；以189?μl純化洗脫液替代所述反應(yīng)體系中的純化gst蛋白作為空白對(duì)照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測體系，其特征在于，所述的除草劑溶液以dmso作為溶劑，所述的gsh溶液以ddh2o作為溶劑，所述的dtnb溶液以dmso作為溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測體系，其特征在于，所述的純化洗脫液為含50?mm咪唑，50mm?nah2po4，300?mm?nacl，ph=7.5的鹽溶液。
4.權(quán)利要求1或2或3所述檢測體系中的試劑在制備高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對(duì)除草劑代謝活性的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種基于gsh-dtnb顯色高通量快速檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶gst對(duì)除草劑代謝活性的試劑盒，其特征在于，該試劑盒中包含權(quán)利要求1或2或3所述檢測體系中的試劑。
6.一種基于gsh-dtnb顯...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馮致科，韋建國，張戰(zhàn)戰(zhàn)，班雅欣，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)三亞研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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