【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學工程領域，具體涉及一種閉合的啞鈴形met激動劑及其應用。
技術介紹
1、血管生成是一個驅動新血管形成的復雜過程，它支持許多生物過程，包括組織再生、器官發育以及提供許多生理活動的條件。血管生成的復雜機制是由獨特的細胞信號通路和轉錄程序精心策劃的，由一系列有效的血管生成因子觸發。例如，met蛋白(間質上皮轉化因子)，它屬于受體酪氨酸激酶，主要參與上皮間充質轉化、胚胎發育以及損傷后的組織修復。肝細胞生長因子hgf被認為是一種有效的血管生成因子。hgf作為生理條件下met受體的關鍵配體，可以調節細胞運動、分裂、存活、分化等多種重要的生物學功能。最近的研究揭示了重組hgf在傷口愈合、組織再生和血管生成等復雜過程中的作用。然而，這種蛋白類的血管生成因子的臨床應用仍然受到半衰期短、不穩定性和體內蛋白酶降解易感等固有挑戰的限制。為了解決這些限制，迫切需要替代策略來模擬hgf的生物效應，同時解決其固有的不穩定性問題。一種很有前景的策略是開發能夠復制重組hgf功能的dna激動劑，所述dna激動劑是指該激動劑本身是由dna構成。
2、合成的dna激動劑是潛在的靶向受體的藥物分子，它能夠模仿基于蛋白質的配體結合和調節細胞表面受體，從而為調節血管生成相關的細胞行為提供有希望的替代方案，這種合成dna激動劑的設計包括將受體結合適體組織成多價結構。最近，研究人員越來越多地使用核酸結構進行多價配體呈遞，以揭示多價增強相互作用的機制并產生高親和力結合劑。當通過核酸支架連接時，dna激動劑能夠對具有多個結合位點的相應受體產生高集體
3、因此，本領域需要開發一種新的met激動劑，所述met激動劑是指該激動劑是可特異性調控met信號通路的dna激動劑，一來解決現有的如hgf等促血管生成因子在臨床應用中存在瞬時活性和分子不穩定性的問題，以提高藥物穩定性和持久活性，以及增強血管調控、生成和組織修復能力；二來解決現有的含柔性支架的dna激動劑的結合力和特異性不夠強，以及其容易被核酸酶降解的問題。
技術實現思路
1、為了解決上述問題，本專利技術提供一種抗核酸酶切的、穩定性強的啞鈴形met激動劑，用于調控met信號通路的激活以及血管化生成，本專利技術建立了一種新型的受體調控工具，克服了傳統藥物的穩定性缺陷，建立了一種更為穩定、親和力更高的藥物并應用于血管內皮細胞在信號和轉錄水平的調控，并在斑馬魚和糖尿病潰瘍小鼠的活體水平中觀察到明顯的治療效果。
2、具體地，本專利技術首先提供一種閉合的啞鈴形met激動劑，所述met激動劑為用于調控met信號通路的閉合的啞鈴形dna激動劑，所述met激動劑命名為cda，其為閉合的核苷酸序列，整體呈啞鈴形，兩端的環部通過中間的頸部連接在一起，頸部序列由反向互補配對的堿基對組成。
3、在一種具體的實施方式中，所述cda兩端的環部均包括34～40個堿基且為功能序列；而其中間的頸部為剛性連接子，且其包括多個堿基對。
4、在一種具體的實施方式中，所述cda的頸部包括13bp，所述cda由命名為ssda的線性met激動劑構建而來，所述ssda的堿基序列如下：
5、atcaggctggatggtagctcggtcggggtgggtgggttggcaagtctgatcgtgt?cacggatggtagctcggtcggggtgggtgggttggcagtgacacg。
6、在一種具體的實施方式中，所述ssda的5’端先進行磷酸化修飾，再使用dna連接酶將ssda的5’端和3’端連接，形成所述cda，優選使用t4連接酶和ssda溶液先在16～22℃下孵育1～2h，再在65～75℃下孵育5～10min得到所述cda。
7、本專利技術還提供一種如上所述的閉合的啞鈴形met激動劑的應用，所述閉合的啞鈴形met激動劑用于細胞或者活體治療中。
8、在一種具體的實施方式中，所述閉合的啞鈴形met激動劑用于調控血管生成，優選用于人或動物糖尿病潰瘍的治療。
9、本專利技術所述閉合的啞鈴形met激動劑中包含剛性連接子，其基于堿基互補配對的原則，形成納米級的剛性支架，所述剛性連接子能夠為met激動劑和met受體提供更好的特異性以及更高的結合力。
10、本專利技術中，當有met受體存在時，cda與met蛋白迅速結合，由于met受體由兩個同源的亞基組成，cda中頸部剛性連接子的存在使得met受體的兩個亞基拉近，從而實現met信號通路的激活，以及下游級聯信號的發生。當微環境中存在核酸酶時，cda能夠穩定獨立存在，保持成閉合的啞鈴形。簡單來說，本專利技術的met激動劑中的兩個環均與met受體結合，它會把met受體的兩個亞基拉攏在一起，而頸部的剛性連接子起到剛性支撐作用，使得met激動劑與met受體的結合強度更高。而ssda在捕獲met受體的兩個亞基時，其頸部會搖擺。
11、本專利技術中，在制備cda的過程中，將上述磷酸化修飾的ssda加入緩沖體系中制備目標激動劑，反應后檢測灰度值，根據灰度值結果即可判定cda的構建情況或計算cda的含量。
12、本專利技術中，所述met激動劑的效果驗證包括：將上述環狀啞鈴形met激動劑cda與活細胞共孵育或將其加入到活體組織的血管化調控部位，一段時間后檢測信號激活強度和血管化程度，根據觀察結果以判定cda的效用。
13、本專利技術設計了一種閉合的啞鈴形met激動劑，它是一種基于dna納米技術下的剛性閉合激動劑，其結構包含一段剛性連接子以及精準靶向met蛋白兩端的環部功能域，這種穩定的產品在結構上類似于啞鈴，其可阻斷核酸酶-核酸鏈的相互作用，以避免潛在的酶降解事件。該啞鈴形met激動劑與現有的血管化調控工具相比，至少具備以下優點：
14、1)它克服了蛋白或線性dna激動劑在生理水平易被酶解的缺陷，閉合的啞鈴形met激動劑cda擁有很強的耐核酸酶解性能；所述cda應用于血管內皮細胞調控met信號通路的激活，促進了血管化的發生。
15、2)與同等濃度的線性met激動劑ssda相比，閉合的啞鈴形met激動劑cda的細胞轉錄組調控事件更多，有效促進了血管化的發生。
16、3)本專利技術所述cda表現出很好的特異性、穩定性以及高親和力，可發展成為促血管化藥物并應用于疾病治療。
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1.一種閉合的啞鈴形Met激動劑，所述Met激動劑為用于調控Met信號通路的閉合的啞鈴形DNA激動劑，所述Met激動劑命名為cDA，其為閉合的核苷酸序列，整體呈啞鈴形，兩端的環部通過中間的頸部連接在一起，頸部序列由反向互補配對的堿基對組成。
2.根據權利要求1所述的閉合的啞鈴形Met激動劑，其特征在于，所述cDA兩端的環部均包括34～40個堿基且為功能序列；而其中間的頸部為剛性連接子，且其包括多個堿基對。
3.根據權利要求2所述的閉合的啞鈴形Met激動劑，其特征在于，所述cDA的頸部包括13bp，所述cDA由命名為ssDA的線性Met激動劑構建而來，所述ssDA的堿基序列如下：
4.根據權利要求3所述的閉合的啞鈴形Met激動劑，其特征在于，所述ssDA的5’端先進行磷酸化修飾，再使用DNA連接酶將ssDA的5’端和3’端連接，形成所述cDA，優選使用T4連接酶和ssDA溶液先在16～22℃下孵育1～2h，再在65～75℃下孵育5～10min得到所述cDA。
5.一種如權利要求1～4中任意一項所述的閉合的啞鈴形Met激動劑的應用，其特
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述閉合的啞鈴形Met激動劑用于調控血管生成，優選用于人或動物糖尿病潰瘍的治療。
...【技術特征摘要】
1.一種閉合的啞鈴形met激動劑，所述met激動劑為用于調控met信號通路的閉合的啞鈴形dna激動劑，所述met激動劑命名為cda，其為閉合的核苷酸序列，整體呈啞鈴形，兩端的環部通過中間的頸部連接在一起，頸部序列由反向互補配對的堿基對組成。
2.根據權利要求1所述的閉合的啞鈴形met激動劑，其特征在于，所述cda兩端的環部均包括34～40個堿基且為功能序列；而其中間的頸部為剛性連接子，且其包括多個堿基對。
3.根據權利要求2所述的閉合的啞鈴形met激動劑，其特征在于，所述cda的頸部包括13bp，所述cda由命名為ssda的線性met激動劑構建而來，所述ssda的堿...
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