【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于酶工程領(lǐng)域，特別涉及一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法。
技術(shù)介紹
1、人肝臟線粒體乙醛脫氫酶2(aldehyde?dehydrogenase?2,aldh2)在人體內(nèi)參與乙醇的降解。乙醇進(jìn)入人體后，首先在乙醇脫氫酶(alcohol?dehydrogenase,adh)的催化作用下生成乙醛，接著，在輔因子nad+的參與下，乙醛脫氫酶2可有效將乙醛水解為乙酸，減少乙醛對人體的傷害。
2、
3、乙醛脫氫酶2存在著一種突變體aldh2*2，其第487位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔钚曰締适АＪ澜缛丝谥杏?％攜帶aldh2*2基因，而東亞攜帶aldh2*2基因人群高達(dá)5.6億。這些人群體內(nèi)由于活性乙醛脫氫酶2的缺失，導(dǎo)致乙醛在人體內(nèi)不能被完全代謝，乙醛刺激臉部的毛細(xì)血管致使其擴(kuò)張，導(dǎo)致臉紅；乙醛還可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，引發(fā)頭痛癥狀；同時(shí)，乙醛可能對胃腸道產(chǎn)生刺激，導(dǎo)致嘔吐等情況的發(fā)生。不僅如此，乙醛脫氫酶2活性的缺失還與酒精性肝病、癌癥、心血管疾病等有一定相關(guān)性。
4、為了能夠深入探究乙醛脫氫酶2在醛類代謝中的作用及其作用機(jī)制，我們需要建立一個(gè)完善的系統(tǒng)來產(chǎn)生可溶形式的乙醛脫氫酶2。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于生長快、成本低、表達(dá)水平高等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用。然而，相關(guān)研究者在利用大腸桿菌進(jìn)行乙醛脫氫酶2表達(dá)的過程中，發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶2多形成包涵體。這種包涵體的形成，使得我們難以直接獲取具有活性的乙醛脫氫酶2，在一定程度上阻礙了對乙醛脫氫酶2的研究。因此，研究在大腸桿菌系統(tǒng)中大量生產(chǎn)可
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)意在提供一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，以實(shí)現(xiàn)從大腸桿菌系統(tǒng)中大量生產(chǎn)可溶性人源乙醛脫氫酶2。
2、本方案中的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，包括以下步驟：
3、步驟一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建：通過bamh?i與xho?i限制性酶切位點(diǎn)將人源乙醛脫氫酶2基因插入質(zhì)粒pet30a(+)中，通過nde?i與kpn?i限制性酶切位點(diǎn)將融合表達(dá)標(biāo)簽nusa基因插入質(zhì)粒pet30a(+)中，得到的重組表達(dá)載體，命名為pet30a(+)-nusa-aldh2；
4、步驟二、重組工程菌培養(yǎng)：將所述重組表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)的菌體并提取質(zhì)粒pet30a(+)-nusa-aldh2并測序，測序正確的菌體為重組工程菌；
5、步驟三、nusa-aldh2的純化：對重組工程菌進(jìn)行接種培養(yǎng)，然后添加終濃度為0.5～1.5mm的乳糖，于15～25℃，150r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)16～20h；誘導(dǎo)結(jié)束，離心收集菌體，使用緩沖液懸浮菌體，再用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，離心收集破碎上清，得到nusa-aldh2粗酶液；使用鎳柱親和層析法純化nusa-aldh2，nusa-aldh2即所述人源乙醛脫氫酶2。
6、進(jìn)一步，所述大腸桿菌選用大腸桿菌rosetta(de3)。
7、進(jìn)一步，將所述重組表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，使用含有45～55μg/ml卡那青霉素的lb固體平板進(jìn)行篩選；在篩選平板上挑取單克隆接種至lb液體培養(yǎng)基中，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養(yǎng)10～15h。
8、進(jìn)一步，對重組工程菌進(jìn)行接種培養(yǎng)時(shí)，將重組工程菌接種至lb液體培養(yǎng)基，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養(yǎng)10～15h，再轉(zhuǎn)接至新鮮lb液體培養(yǎng)基，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養(yǎng)0.8～1.5h。
9、進(jìn)一步，所述緩沖液選用lysis?buffer緩沖液。
10、進(jìn)一步，所述重組工程菌再轉(zhuǎn)接至新鮮lb液體培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)1h后添加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。
11、進(jìn)一步，所述乳糖的終濃度為1mm。
12、進(jìn)一步，乳糖誘導(dǎo)溫度為20℃。
13、進(jìn)一步，乳糖誘導(dǎo)時(shí)間為20h。
14、進(jìn)一步，使用鎳柱親和層析法純化nusa-aldh2的具體步驟如下：
15、(1)鎳柱平衡：在鎳柱中加入5倍柱體積的lysis?buffer，通過重力流出，平衡柱子；
16、(2)上樣：將所述nusa-aldh2粗酶液加到上述平衡后的鎳柱中，重力流出；
17、(3)洗雜：在鎳柱中，加入10倍柱體積的washing?buffer(50mm?tris，300mm?nacl，30mm咪唑)，重力流出，將與鎳柱結(jié)合的雜蛋白洗出；
18、(4)洗脫：在鎳柱中，加入2倍柱體積的elution?buffer(50mm?tris，300mm?nacl，300mm咪唑)，重力流出，此時(shí)目的蛋白被置換洗出，收集此部分洗脫液；
19、(5)透析：將洗脫液轉(zhuǎn)移到14kd透析袋中，透析袋置于20mm?tris-hcl緩沖液中，透析過夜，以降低酶液中的咪唑濃度。
20、有益效果：
21、1、本專利通過融合表達(dá)的手段來獲得可溶性的乙醛脫氫酶2，免去繁瑣復(fù)雜的復(fù)性工作，簡化了乙醛脫氫酶2的純化工作。
22、2、本專利使用廉價(jià)的乳糖作為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)乙醛脫氫酶2基因的表達(dá)，不僅價(jià)格低廉，且對細(xì)胞無毒性作用。
23、3、使用乳糖作為誘導(dǎo)劑，能夠在轉(zhuǎn)菌完成后立即進(jìn)行誘導(dǎo)，無需將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，這一特性在簡化操作流程的同時(shí)，有效節(jié)省了寶貴的時(shí)間成本，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述大腸桿菌選用大腸桿菌Rosetta(DE3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：將所述重組表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，使用含有45～55μg/mL卡那青霉素的LB固體平板進(jìn)行篩選；在篩選平板上挑取單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中，添加終濃度為45～55μg/mL的卡那青霉素，于35～40℃，180～220r/min的條件下培養(yǎng)10～15h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：對重組工程菌進(jìn)行接種培養(yǎng)時(shí)，將重組工程菌接種至LB液體培養(yǎng)基，添加終濃度為45～55μg/mL的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養(yǎng)10～15h，再轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基，添加終濃度為45～55μg/mL的卡那青霉素，于35～40℃,180～
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述緩沖液選用Lysis?buffer。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述重組工程菌再轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)1h后添加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述乳糖的終濃度為1mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：乳糖誘導(dǎo)溫度為20℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：乳糖誘導(dǎo)時(shí)間為20h。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：使用鎳柱親和層析法純化NusA-ALDH2的具體步驟如下：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述大腸桿菌選用大腸桿菌rosetta(de3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：將所述重組表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，使用含有45～55μg/ml卡那青霉素的lb固體平板進(jìn)行篩選；在篩選平板上挑取單克隆接種至lb液體培養(yǎng)基中，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃，180～220r/min的條件下培養(yǎng)10～15h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種結(jié)合融合表達(dá)與乳糖誘導(dǎo)生產(chǎn)人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：對重組工程菌進(jìn)行接種培養(yǎng)時(shí)，將重組工程菌接種至lb液體培養(yǎng)基，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養(yǎng)10～15h，再轉(zhuǎn)接至新鮮lb液體培養(yǎng)基，添加終濃度為45～55μg/m...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李紅霞，唐啟梅，王雄，王新葉，張璋，趙亮，羅貞標(biāo)，
申請(專利權(quán))人：茅臺學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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