【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子檢測，具體涉及一種檢測端粒酶活性的檢測試紙和檢測試劑盒及應用。
技術介紹
1、端粒酶(telomerase)一種由rna和蛋白質組成的特殊反轉錄酶，與真核生物細胞dna末端的端粒(一段特定的核苷酸序列及結構)的合成有關。正常體細胞的端粒長度是隨著細胞的分裂逐漸縮短的，端粒酶活性增強，可維持端粒的長度不縮短，使細胞永久增殖而癌變。故而對端粒酶活性進行檢測可用于腫瘤的診斷。
2、傳統的檢測端粒酶活性的技術主要是建立在聚合酶鏈反應(pcr)基礎上的對端粒酶重復延伸片段(ttaggg)進行擴增(trap)來檢測端粒酶活性，此外，還有諸如基于熒光、電化學等響應信號的檢測方法，但這些方法仍存在檢測靈敏度較低，存在一定的假陽性率的問題。
技術實現思路
1、基于現有技術中的不足，本專利技術的首要目的在于提供一種檢測端粒酶活性的檢測檢測試紙，該檢測試紙通過膠體金顯色和熒光檢測，能夠實現端粒酶活性的快速雙重可視化檢測(雙響應)，具有對端粒酶延伸產物響應靈敏迅速，靈敏度高的優勢，可極大的減少端粒酶活性檢測中假陽性率的問題。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、本專利技術的一個方面提供了一種檢測端粒酶活性的檢測試紙，其包括底板，所述底板表面設有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的兩端分別設有樣品板和吸水板，所述樣品板和吸水板均位于所述硝酸纖維素膜的上部且與之部分搭接，所述硝酸纖維素膜上設有測試區，所述測試區內印刷有靠近樣品板的第一檢測線
4、其中，所述第一、二檢測線是鏈霉親和素-生物素化的第一、二捕獲探針序列分別通過印刷形成的，所述第一捕獲探針用于捕捉端粒酶反應后延伸的dna頸環結構，所述第二捕獲探針用于捕捉端粒酶反應后替換下來的連接有熒光基團的dna序列。
5、其中，所述第一捕獲探針的核苷酸序列如seq?id?no.3(ccctaaccctaaccct)所示；
6、所述第二捕捉探針的核苷酸序列如seq?id?no.4(gcccctaac)所示。
7、本專利技術的另一個方面提供了一種檢測端粒酶活性的檢測試劑盒，包括上文所述的檢測試紙和延伸反應液，所述延伸反應液包括膠體金球形核酸探針溶液，所述膠體金球形核酸探針是以膠體金納米顆粒為內核，在所述膠體金納米顆粒表面修飾雙鏈dna形成的；
8、其中，所述雙鏈dna由dna長鏈tp-chain和dna短鏈fl-chain雜交形成，且所述dna長鏈tp-chain含有端粒酶引物序列，所述dna短鏈fl-chain的3’端修飾有熒光基團。
9、其中，所述dna長鏈tp-chain具有seq?id?no.1(tttttgcccctaaccctaaaatccgtcgagcagagtt)所示的核苷酸序列，且在5’端連接有巰基；
10、所述dna短鏈fl-chain具有seq?id?no.2(gttaggggc)所示的核苷酸序列，且在3’端連接有熒光基團。
11、本專利技術的另一個方面提供了一種端粒酶活性檢測的方法，包括以下步驟：
12、提供上文所述的檢測試劑盒；
13、提取細胞內的端粒酶；
14、向延伸反應液中加入待測端粒酶提取物，恒溫孵育獲得檢測溶液；
15、將所述檢測溶液滴加至所述檢測試劑盒的樣品板中，觀察檢測試線上膠體金的顏色和熒光變化。
16、本專利技術的另一個方面還提供了上文所述的檢測試紙或檢測試劑盒在端粒酶活性檢測或可視化檢測腫瘤細胞中的應用。
17、本專利技術的有益效果：
18、本專利技術中的檢測試紙，通過膠體金顯色和熒光檢測結合，實現對端粒酶活性的雙重響應，達到對端粒酶活性的裸眼可視化效果，簡單，直觀。與單一顯色試紙相比，更可靠，有效降低假陽性率。
19、本專利技術的檢測試紙將鏈霉親和素-生物素化的捕獲探針序列印刷至硝酸纖維素膜上，與目標物相結合，具有級聯放大效應，可以提高檢測靈敏度。并且本專利技術中的捕獲探針序列固定在測試區，使得檢測后的金納米粒子固定在測試區，從而保證顯色結構的長期保存。
20、本專利技術中的檢測試劑盒將dna-膠體金納米探針與熒光基團修飾的dna短鏈fl-chain進行孵育獲得雙鏈dna-膠體金納米顆粒球形核酸探針，實現對端粒酶序列的特異性檢測的雙重響應。
21、此外，本專利技術對端粒酶活性的檢測具有快速、便捷可視化的優勢，只需將與端粒酶反應后的樣品滴加至檢測試紙上，幾分鐘(如5min)內即可顯色，可以肉眼直接觀察，而無需其它輔助工具。
22、本專利技術中的檢測試紙和檢測試劑盒能夠實現對腫瘤細胞中的端粒酶活性的定性分析，通過裸眼和紫外光源區分是否腫瘤細胞，建立腫瘤細胞裸眼可視化和熒光可視化的雙重響應體系。并且這種探針在細胞中端粒酶活性檢測過程中，無需清洗，可以直接用于裸眼觀察，具有顯著的優勢。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種檢測端粒酶活性的檢測試紙，其包括底板，所述底板表面設有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的兩端分別設有樣品板和吸水板，所述樣品板和吸水板均位于所述硝酸纖維素膜的上部且與之部分搭接，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上設有測試區，所述測試區內印刷有靠近樣品板的第一檢測線和靠近吸水板的第二檢測線；
2.如權利要求1所述的檢測端粒酶活性的檢測試紙，其特征在于，所述第一捕獲探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；
3.如權利要求1所述的檢測端粒酶活性的檢測試紙，其特征在于，所述測試區還包括對照線，所述對照線位于第二檢測線和吸水板之間，所述對照線是鏈霉親和素-生物素化對照探針序列通過印刷形成的，所述所述對照探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。
4.如權利要求1所述的檢測端粒酶活性的檢測試紙，其特征在于，所述樣品板上含有交聯緩沖液；
5.一種檢測端粒酶活性的檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-4任一項所述的檢測試紙和延伸反應液，所述延伸反應液包括膠體金球形核酸探針溶液，所述膠體金球形核酸探針是以膠體金納米顆粒為內核，在所述膠體
6.如權利要求5所述的檢測端粒酶活性的檢測試劑盒，其特征在于，所述膠體金球形核酸探針溶液的濃度為5nM～2mM。
7.如權利要求5所述的檢測端粒酶活性的檢測試劑盒，其特征在于，所述膠體金球形核酸探針的制備包括以下步驟：
8.如權利要求5所述的檢測端粒酶活性的檢測試劑盒，其特征在于，所述延伸反應液還包括擴增緩沖液和dNTPs；
9.一種端粒酶活性檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.如權利要求1-4任一項所述的檢測試紙或權利要求5-8任一項所述的檢測試劑盒在端粒酶活性檢測或可視化檢測腫瘤細胞中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種檢測端粒酶活性的檢測試紙，其包括底板，所述底板表面設有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的兩端分別設有樣品板和吸水板，所述樣品板和吸水板均位于所述硝酸纖維素膜的上部且與之部分搭接，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上設有測試區，所述測試區內印刷有靠近樣品板的第一檢測線和靠近吸水板的第二檢測線；
2.如權利要求1所述的檢測端粒酶活性的檢測試紙，其特征在于，所述第一捕獲探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；
3.如權利要求1所述的檢測端粒酶活性的檢測試紙，其特征在于，所述測試區還包括對照線，所述對照線位于第二檢測線和吸水板之間，所述對照線是鏈霉親和素-生物素化對照探針序列通過印刷形成的，所述所述對照探針的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
4.如權利要求1所述的檢測端粒酶活性的檢測試紙，其特征在于，所述樣品板上含有交聯緩沖液；
5.一種...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王振洋，趙君，劉變化，
申請(專利權)人：中國科學院合肥物質科學研究院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。