【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥，具體涉及一種脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原及其應用。
技術介紹
1、冠狀病毒是一類具有包膜的單正鏈rna病毒，屬于冠狀病毒科，已知可感染人類的冠狀病毒共有7種，目前可導致嚴重疾病甚至死亡的是sars-cov、sars-cov-2和mers-cov。冠狀病毒的主要結構蛋白包括刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和核衣殼蛋白(n)，其中s蛋白位于冠狀病毒包膜表面，可識別宿主細胞受體并通過構象改變介導病毒與宿主細胞的膜融合。例如，sars-cov和sars-cov-2的受體是血管緊張素轉化酶2（ace2,angiotensin?converting?enzyme?2)，mers-cov的受體是二肽基肽酶-4（dpp4,dipeptidyl?peptidase?4）。在s蛋白中，rbd（receptor-binding?domain）作為獨立的結構域具有與受體結合的能力，由于rna病毒復制過程缺乏矯正機制，編碼蛋白持續變異，在選擇壓力的篩選下，各種突變株的rbd依然保持與受體特異性結合的能力。例如sars-cov-2病毒自2019年底出現以來，被世界衛生組織認定為需要關注的變異株（variant?of?concern，voc）就有阿爾法（alpha）、貝塔（beta）、伽瑪（gamma）、德爾塔（delta）和奧密克戎（omicron）五大類，未來各種變異株還將不斷出現。rbd是s蛋白的免疫優勢區，包含絕大多數的中和表位，是理想的候選抗原。然而，rbd分子量較小、免疫原性相對較低，阻礙了以rbd為抗原的亞單位
2、細菌中存在一類n末端半胱氨酸（cys）被脂肪酸化修飾并通過脂肪酸鏈固定在細胞表面的蛋白，稱為細菌脂蛋白。細菌脂蛋白的體內合成是在信號肽的引導下完成的，對細菌天然脂肪酸化修飾和非脂肪酸化修飾蛋白的信號肽序列進行生物信息學和統計學分析，發現脂肪酸化修飾蛋白的信號肽在臨近信號肽酶切割位點為非極性氨基酸，并具有一定的保守性，歸納總結發現這一區域最后四位氨基酸的保守序列為[l/v/i][a/s/t/v/i][g/a/s][c]，其中c末端的半胱氨酸是脂化修飾位點。在信號肽的引導下，新生肽鏈經sec或tat分泌途徑分定位至細胞膜外側，lgt酶以磷脂酰甘油（pg，phosphatidylglycerol）為底物，將二酰基甘油連接至cys的巰基上，lspa酶切除信號肽除c端cys外的部分，lnt酶以磷脂酰乙醇胺（pe）為底物將一條脂肪酸鏈轉移至cys的alpha-氨基上。細菌脂肪酸化修飾是不均一的，主要表現在脂肪酸鏈的數量、脂肪酸鏈的長度等方面，細菌脂蛋白的脂酰基碳鏈長度通常在c14-c18之間，但絕大多數脂酰基碳鏈長度為c16。
3、將抗原展示在蛋白納米載體表面是提高抗原免疫原性的有效手段。納米顆粒和負載抗原分別表達制備，通過一種通用、高效、可控的連接方法將載體和負載抗原連接的制備方案（模塊化制備方案）可有效解決因載體與抗原融合表達帶來的表達效率低、顆粒組裝失敗、結構不穩定性及免疫原性丟失等問題。spytag/spycatcher連接系統是研究最為深入的蛋白連接系統之一，此系統因反應迅速、特異、對反應條件寬泛、反應不可逆等優點廣泛用于疫苗開發與研究，將其分別與病原體抗原、合適的載體蛋白融合表達，可以實現抗原與載體蛋白的精準共價連接，特別是可實現抗原在自聚合納米載體蛋白表面重復展示，提高了抗原的提呈效率和免疫原性。此連接系統源于釀膿鏈球菌（streptococcus?pyogenes）纖連蛋白結合蛋白（fibronectin-binding?protein）的cnab2結構域，cnab2結構域的lys31和asp117可形成分子內異肽鍵，將cnab2結構域拆分為含有lys31的n端結構域（spycatcher,116aa）和含有asp117的c末端多肽（spytag,?13aa）后，兩個片段依然可形成特異的異肽鍵。為了進一步優化spytag/spycatcher連接系統，mark?howarth團隊分析了其結構與功能之間的關系，證明了能夠形成異肽鍵所需的最小spycatcher；為了提高連接反應速度和效率，該團隊對spytag（13aa）/spycatcher（116aa）連接系統進行人工設計，開發出spytag002/spycatcher002和spytag003/spycatcher003連接系統。
4、在現有技術中，將保護性抗原展示在蛋白納米顆粒表面、和/或物理混合或包埋佐劑、以及利用病毒載體遞送抗原是提高黏膜疫苗免疫原性的有效手段，然而載體帶來的預存免疫問題、免疫聚焦失衡問題、過量使用佐劑帶來的安全性問題困擾著黏膜疫苗的開發。因此有必要開發一種新的策略，在提高抗原免疫原性的同時，既降低載體蛋白免疫印記效應和/或免疫優勢，又能夠降低佐劑帶來的副反應。
技術實現思路
1、為了解決現有技術的不足，本專利技術提供了一種脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原及其應用。
2、依據本專利技術技術方案的第一方面，提供一種脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原。其中，所述脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原包含脂肪酸化修飾的n末端半胱氨酸（cys）。
3、所述脂肪酸化修飾的n末端半胱氨酸(cys)具體為cys的巰基被二脂酰基甘油修飾，或cys的巰基被二脂酰基甘油修飾且α氨基被脂酰基修飾。
4、所述冠狀病毒包括但不限于sars-cov-2、sars-cov或mers-cov。
5、所述冠狀病毒的抗原優選的為冠狀病毒s蛋白或其部分功能片段。
6、所述冠狀病毒s蛋白部分功能片段為受體結合域（rbd）或n末端結構域（ntd），優選的是rbd。
7、所述sars-cov、sars-cov-2冠狀病毒抗原中，受體結合結構域rbd包括sars-cov-2和sars-covs蛋白與ace2結合的區域及其變異體，其氨基酸序列包括但不限于seq?idno.1-9任一所述序列；
8、所述mers-cov冠狀病毒抗原中，受體結合結構域rbd包括mers-cov?s蛋白與dpp4結合的區域或其變異體；其氨基酸序列包括但不限于seq?id?no.10任一所述序列。
9、本專利技術所提供的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原還可以含有連接結構域。
10、所述連接結構域為異肽鍵連接體，優選的為spycatcher/spytag連接體。
11、所述冠狀病毒抗原與spytag多肽融合表達，與脂肪酸化修飾的spycatcher蛋白通過異肽鍵共價連接；或，所述冠狀病毒抗原與spycatcher蛋白融合表達，與脂肪酸化修飾的spytag多肽通過異肽鍵共價連接。
12、所述spycatcher蛋白為含有如seq?id?no.11-13之任一氨基酸序列的多肽，所述spytag的氨基酸序列如seq?id?no.14-16任一所示。
13、當所述spycatcher蛋白包含seq?id?n本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原。
2.根據權利要求1所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，其含有脂肪酸化修飾的N末端半胱氨酸（Cys）。
3.根據權利要求2所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的N末端半胱氨酸(Cys)具體為Cys的巰基被二脂酰基甘油修飾，或Cys的巰基被二脂酰基甘油修飾且α氨基被脂酰基修飾。
4.根據權利要求1-3之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述冠狀病毒包括但限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。
5.根據權利要求1-4之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV病毒抗原為刺突蛋白或其部分功能片段。
6.根據權利要求5所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述功能片段為受體結合結構域（RBD）和/或N末端結構域（NTD），優選的是RBD。
7.根據權利要求4所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述SARS-CoV、SARS
8.根據權利要求4所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述MERS-CoV冠狀病毒抗原中，受體結合結構域RBD包括具有與DPP4結合能力的區域及其變異體。
9.根據權利要求6-8之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述受體結合結構域RBD包括SEQ?ID?No.1-10任一所述序列。
10.根據權利要求1-2之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原還含有連接結構域。
11.根據權利要求10所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述連接結構域為異肽鍵連接體，具體為SpyCatcher/SpyTag連接體。所述冠狀病毒抗原與SpyTag多肽融合表達，與脂肪酸化修飾的SpyCatcher蛋白通過異肽鍵共價連接；或，所述冠狀病毒抗原與SpyCatcher蛋白融合表達，與脂肪酸化修飾的SpyTag多肽通過異肽鍵共價連接。
12.根據權利要求11所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述SpyCatcher蛋白為含有如SEQ?ID?No.11-13之任一氨基酸序列的多肽，優選的是含有SEQID?No.11所示氨基酸序列的多肽。
13.根據權利要求11所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述SpyTag多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.14-16任一所示，優選的是SEQ?ID?No.14所示的氨基酸序列。
14.一種制備如權利要求1-9之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原的方法，所述方法包括：
15.一種制備如權利要求10-13之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原的方法，所述方法包括：
16.根據權利要求14-15之任一所述的方法，其特征在于，所述信號肽保守序列包含C末端最后四位的氨基酸序列為[L/V/I][A/S/T/V/I][G/A/S][C]。
17.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述信號肽為SEQ?ID?No.17-19的任一序列。
18.如權利要求1-13之任一所述的脂肪酸化修飾冠狀病毒抗原的應用，其特征在于，所述應用為制備疫苗，或者篩選治療冠狀病毒的藥物。
19.一種含有權利要求1-13之任一所述的脂肪酸化修飾冠狀病毒抗原的疫苗。
20.根據權利要求19所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為呼吸道粘膜免疫疫苗或注射用疫苗。
21.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含權利要求1-13之任一所述的脂肪酸化修飾冠狀病毒抗原。
22.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含編碼權利要求1-13之任一所述的脂肪酸化修飾冠狀病毒抗原的核酸。
23.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含編碼權利要求1-13之任一所述的脂肪酸化修飾冠狀病毒抗原的載體。
24.生物材料，其特征在于，所述生物材料為下述之任一種：
25.一種利用權利要求1-14之任一所述的脂肪酸化修飾冠狀病毒抗原制備疫苗的方法。
26.一種利用權利要求25所述的生物材料制備疫苗的方法。
...【技術特征摘要】
1.一種脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原。
2.根據權利要求1所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，其含有脂肪酸化修飾的n末端半胱氨酸（cys）。
3.根據權利要求2所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的n末端半胱氨酸(cys)具體為cys的巰基被二脂酰基甘油修飾，或cys的巰基被二脂酰基甘油修飾且α氨基被脂酰基修飾。
4.根據權利要求1-3之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述冠狀病毒包括但限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov。
5.根據權利要求1-4之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述sars-cov-2、sars-cov或mers-cov病毒抗原為刺突蛋白或其部分功能片段。
6.根據權利要求5所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述功能片段為受體結合結構域（rbd）和/或n末端結構域（ntd），優選的是rbd。
7.根據權利要求4所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述sars-cov、sars-cov-2冠狀病毒抗原中，受體結合結構域rbd包括具有與ace2結合能力的區域及其變異體。
8.根據權利要求4所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述mers-cov冠狀病毒抗原中，受體結合結構域rbd包括具有與dpp4結合能力的區域及其變異體。
9.根據權利要求6-8之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述受體結合結構域rbd包括seq?id?no.1-10任一所述序列。
10.根據權利要求1-2之任一所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原還含有連接結構域。
11.根據權利要求10所述的脂肪酸化修飾的冠狀病毒抗原，其特征在于，所述連接結構域為異肽鍵連接體，具體為spycatcher/spytag連接體。所述冠狀病毒抗原與spytag多肽融合表達，與脂肪酸化修飾的spycatcher蛋白通過異肽鍵共價連接；或，所述冠狀病毒抗原與spycatcher蛋白融合表達，與脂肪酸化修飾的spytag多...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳軍，劉波，王甜甜，徐惠芳，孫鵬，張斌，侯旭宸，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，
類型：發明
國別省市：
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