【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物測序領(lǐng)域，尤其涉及合成測序技術(shù)在空間轉(zhuǎn)錄組編碼微球芯片上的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、空轉(zhuǎn)編碼微球芯片探針序列測定技術(shù)是一種結(jié)合了微球技術(shù)和核酸探針雜交技術(shù)的方法，用于高通量地檢測和分析dna或rna序列。這項技術(shù)在分子生物學(xué)、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。以下是一些現(xiàn)有的微球探針序列測定技術(shù)：1.luminex?xmap?技術(shù)：原理：luminex?xmap（multiplexed?analyte?profiling）技術(shù)使用不同熒光編碼的微球，每種微球攜帶特定的dna或rna探針。樣本中的目標(biāo)核酸與探針雜交后，通過熒光檢測器讀取信號，實現(xiàn)多靶標(biāo)的同時檢測。應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于基因分型、病原體檢測、snp（單核苷酸多態(tài)性）分析等領(lǐng)域。2.?flow?cytometry（流式細(xì)胞術(shù)）：原理：利用流式細(xì)胞儀檢測微球上的熒光信號。微球表面固定有特定的核酸探針，與樣本中的目標(biāo)核酸雜交后，通過流式細(xì)胞儀的激光激發(fā)熒光，讀取信號并進(jìn)行分析。應(yīng)用：常用于細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測、細(xì)胞內(nèi)核酸的定量分析等。3.?quantiarray?微球陣列技術(shù)：原理：quantiarray技術(shù)將不同類型的微球固定在一個陣列上，每個微球攜帶特定的核酸探針。樣本中的目標(biāo)核酸與探針雜交后，通過熒光掃描儀讀取信號，實現(xiàn)高通量的序列測定。應(yīng)用：主要用于基因表達(dá)譜分析、突變檢測等。4.?nanostring?ncounter?技術(shù)：原理：nanostring?ncounter技術(shù)使用帶有條形碼的探針，這些探針與目標(biāo)核酸雜交后形成復(fù)合物。通過光學(xué)成像系
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)提供了合成測序技術(shù)在空間轉(zhuǎn)錄組編碼微球芯片上的應(yīng)用。本專利技術(shù)采用合成測序技術(shù)測定微球探針的序列，其主要實施思路為：將探針微球密鋪在載體上，添加引物與載體探針雜交，利用合成測序反應(yīng)獲取探針序列。具體為在載體上的探針微球上加入帶有四色熒光的可逆終止子，在反應(yīng)緩沖液中，在擴(kuò)增酶的作用下，合成一個核苷酸，隨后經(jīng)激光激發(fā)熒光獲取光信號，獲取此堿基的信息，之后再洗脫可逆終止子上的熒光信號以及阻斷基團(tuán)，進(jìn)入新的一輪反應(yīng)獲取下一個堿基信息。本專利技術(shù)簡實驗方案簡便，有效節(jié)省時間，降低成本，可以高效準(zhǔn)確地完成探針序列的測定。
2、為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了測序方法，包括如下步驟：
4、s1：將偶聯(lián)有探針的微球與載體連接，獲得微球芯片；
5、s2：將雜交引物與所述探針雜交，獲得探針-引物復(fù)合物；
6、s3：通過聚合反應(yīng)將四種攜帶不同光學(xué)檢測標(biāo)記的核苷酸與所述探針-引物復(fù)合物結(jié)合，單堿基延伸，獲得延伸產(chǎn)物；
7、s4：激發(fā)所述光學(xué)檢測標(biāo)記產(chǎn)生光學(xué)信號，對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行成像，獲得圖像；
8、s5：清除所述光學(xué)檢測標(biāo)記；
9、s6：重復(fù)s3至s5，至直測序完成；
10、s7：解鏈，獲得測序結(jié)果；
11、所述探針包括：待測序列和固定序列；所述固定序列具有如seq?id?no:1所示的序列；
12、所述雜交引物和所述固定序列的序列互補(bǔ)。
13、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，seq?id?no:1的序列為：tagctgcttcagcgt。
14、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法中，所述微球的數(shù)量大于或等于1。
15、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法中，當(dāng)所述微球不同時，所述待測序列不同。
16、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法中，所述光學(xué)檢測標(biāo)記選自dapi、fitc、alexa?fluor?488、af532、af700、cy3、cy5、tritc、cy7。
17、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s1中所述連接采用離心的方法，所述離心的轉(zhuǎn)速為1000g，時間為10min。
18、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s2中所述雜交的時間為5min~10min，溫度為40~44℃。
19、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s2中所述雜交的時間為5min，溫度為42℃。
20、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s3中所述擴(kuò)增采用擴(kuò)增緩沖液、擴(kuò)增酶和dntp。
21、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法所述擴(kuò)增緩沖液包括：20?mm?tris-hcl、10?mm?(nh4)2so4、10?mm?kcl、2~10?mm?mgso4、0.05~0.2%（w/w）triton?x-100。
22、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法所述dntp帶有熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)。
23、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法所述熒光基團(tuán)和/或所述阻斷基團(tuán)修飾有疊氮基團(tuán)或終二硫鍵。
24、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法所述熒光基團(tuán)和/或所述阻斷基團(tuán)修飾有疊氮基團(tuán)。
25、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s4中所述清除的時間為1min~5min，溫度為42~65℃。
26、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s4中所述清除的時間為1min，溫度為42~65℃。
27、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s4中所述清除采用25mm~50mm?tcep。
28、在本專利技術(shù)的一些實施方案中，上述測序方法s4中所述清除采用50mm?tcep。
29、本專利技術(shù)簡實驗方案簡便，有效節(jié)省時間，降低成本，可以高效準(zhǔn)確地完成探針序列的測定。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.測序方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的測序方法，其特征在于，所述微球的數(shù)量大于或等于1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的測序方法，其特征在于，所述光學(xué)檢測標(biāo)記選自DAPI、FITC、Alexa?fluor?488、AF532、AF700、Cy3、Cy5、TRITC、Cy7。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的測序方法，其特征在于，S1中所述連接采用離心的方法，所述離心的轉(zhuǎn)速為1000g，時間為10min。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的測序方法，其特征在于，S2中所述雜交的時間為5min~10min，溫度為40~44℃。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的測序方法，其特征在于，S3中所述擴(kuò)增采用擴(kuò)增緩沖液、擴(kuò)增酶和dNTP。
7.如權(quán)利要求6所述的測序方法，其特征在于，所述擴(kuò)增緩沖液包括：20?mM?Tris-HCl、10?mM?(NH4)2SO4、10?mM?KCl、2~10?mM?MgSO4、0.05~0.2%（w/w）Triton?X-100。
8.如權(quán)利要求6或7所述的
9.如權(quán)利要求1至8任一項所述的測序方法，其特征在于，S4中所述清除的時間為1min~5min，溫度為42~65℃。
10.如權(quán)利要求9所述的測序方法，其特征在于，S4中所述清除采用25mM~50mM?TCEP。
...【技術(shù)特征摘要】
1.測序方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的測序方法，其特征在于，所述微球的數(shù)量大于或等于1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的測序方法，其特征在于，所述光學(xué)檢測標(biāo)記選自dapi、fitc、alexa?fluor?488、af532、af700、cy3、cy5、tritc、cy7。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的測序方法，其特征在于，s1中所述連接采用離心的方法，所述離心的轉(zhuǎn)速為1000g，時間為10min。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的測序方法，其特征在于，s2中所述雜交的時間為5min~10min，溫度為40~44℃。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的測序...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王冰，劉志康，張峰，黃慧嫦，周董華，
申請(專利權(quán))人：利德健康科技廣州有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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