【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥。具體涉及一種小核酸組合物及其制備藥物的應(yīng)用和產(chǎn)品。
技術(shù)介紹
1、心肌細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡或紊亂乃是各類型心血管疾病的共同特征和標志，也是其發(fā)病機制之一。心肌鈣離子穩(wěn)態(tài)的維持依賴于一系列鈣調(diào)控相關(guān)蛋白、離子通道和酶所構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精細調(diào)節(jié)。鈣離子處理蛋白serca2a（sarcoplasmic?reticulum?calciumatpase2a，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子atp酶）負責(zé)將心臟收縮期間通過鈣通道進入細胞以及從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池釋放到細胞質(zhì)中的ca2+于舒張期回攝至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，降低胞漿內(nèi)ca2+濃度，使ca2+與肌鈣蛋白c解離，心肌細胞舒張。大約95%的胞漿鈣離子是由serca2a回收到肌漿網(wǎng)的，是參與心肌細胞鈣調(diào)控過程和維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的關(guān)鍵分子。正常情況下，細胞內(nèi)大部分的ca2+都儲存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在細胞收縮時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的ca2+大量釋放，胞漿ca2+濃度瞬間增高，引起細胞收縮；細胞收縮后serca2a回攝ca2+使胞漿內(nèi)ca2+濃度恢復(fù)正常水平，serca2a對于維持細胞內(nèi)ca2+穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。
2、serca2a的功能或表達異常都會損傷心肌細胞收縮功能，進而損傷整體心臟功能。在各類心血管疾病中，包括急性心肌梗死、心肌肥厚、心力衰竭、糖尿病心肌病等，serca2a的表達下調(diào)且功能受損，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取ca2+減少，胞質(zhì)中ca2+濃度下降速度和幅度不足，延緩心肌舒張；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ca2+儲存量減少，心肌收縮釋放ca2+減少，心肌收縮功能下降。serca2a的表達下調(diào)和功能受損會造成細胞內(nèi)鈣超載，激活心肌細胞凋亡通路，導(dǎo)
3、serca2a由atp2a2基因編碼。過去的基因結(jié)構(gòu)以及前期的生信分析顯示atp2a2是mir-133、let-7、mir-142-3p和mir-30分子靶點，并具有高度的跨種屬保守性，而且這些mirna在心肌的表達豐度比較高，故其對atp2a2的表達抑制作用也比較強，因此是實施微小rna（mirna）干擾技術(shù)以拯救atp2a2表達水平的理想靶點。
4、在細胞中，每一個基因或編碼蛋白質(zhì)的信使rna（mrna）都可能同時與多個微小rna（mirna）配對結(jié)合，后者會抑制該靶mrna翻譯成為相應(yīng)蛋白質(zhì)的過程，同時會降解該靶mrna，使之表達水平和細胞功能受到這些微小rna的抑制。如果某一基因?qū)δ骋环N疾病而言屬于致病基因，則可以應(yīng)用微小rna來抑制該基因的表達和功能，而這些微小rna可被視為抗病微小rna；然而，如果該基因是一個抗病基因，則應(yīng)該得到保護，而保護該基因的策略之一就是解除微小rna對其的抑制作用。最常用的具體方法是應(yīng)用微小rna反義核苷酸（amo或antimir或antagomir）技術(shù)來敲減這些微小rna。但是，單單敲減所有能夠抑制該基因的眾多微小rna當(dāng)中的某個，都可能因為其它微小rna的存在而維持對該靶mrna的抑制作用，換句話說，就是干擾或敲減眾多參與抑制同一靶mrna的微小rna中的任何一個，都不足以解除對靶基因的抑制作用。這是目前仍然面臨的靶向微小rna來解除基因抑制的一個極大的挑戰(zhàn)。
5、另外一方面，由于微小rna可以同時作用于多個靶基因（mrna），包括致病基因和抗病基因。因此，應(yīng)用amo技術(shù)敲減某一微小rna時，會同時消減或解除其對致病基因和抗病基因的抑制作用。其后果就是在消減該微小rna有害作用的同時，也抑制了該微小rna的有益功能，從而出現(xiàn)治療某種疾病的同時，引發(fā)另外一種疾病的發(fā)生發(fā)展。這不僅是臨床實踐中極為忌諱的“毒副作用”，也是意圖靶向微小rna治療疾病所面臨的另外一個嚴重的挑戰(zhàn)。
6、專利cn101054576a公開了一種mirna屏障技術(shù)，該技術(shù)通過測定目標nrna的3′utr內(nèi)與mirna結(jié)合的靶向基因序列，合成可與靶向基因序列嚴密結(jié)合的特異性反義寡聚屏障序列，將特異性反義寡聚屏障序列導(dǎo)入細胞與目標mrna形成二倍體，即可屏障靶向mrna的mirna。該mirna屏障技術(shù)目前已經(jīng)被業(yè)界視為今后小核酸藥物新藥發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的一個重要策略。然而，該技術(shù)的弱點已經(jīng)暴露，那就是上述的屏障單一個微小rna的作用，往往難以達到最佳效果，甚至還無法達到預(yù)期應(yīng)有的藥效。其主要緣由就是單一位點的mirna屏障技術(shù)無法解除其它關(guān)鍵性微小rna對同一靶基因的抑制作用所致。
7、為了同時化解上述的微小rna面臨的兩個挑戰(zhàn)，需要探索新的技術(shù)，能夠特異性地解除多個關(guān)鍵性微小rna對某一抗病基因的抑制作用，同時能夠避免干擾這些微小rna對其它基因的抑制作用，特別是對致病基因的抑制作用。也就是說，這種技術(shù)必須能夠同時保護抗病基因的表達和功能不被抑制，且維持對致病基因的抑制。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對上述不足，本專利技術(shù)提供了一種小核酸組合物及其制備藥物的應(yīng)用和產(chǎn)品。本專利技術(shù)針對atp2a2?mrna的3'-末端非翻譯區(qū)序列中所包含的mir-133、let-7、mir-142-3p和mir-30種子序列的四個區(qū)域，設(shè)計了一段包含四個相應(yīng)的反義寡核苷酸片段的小核酸組合物aso133/7/142/30，具有如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。采用本專利技術(shù)提供的小核酸組合物能夠增加hl-1細胞中atp2a2表達水平，顯著提高心臟組織中atp2a2表達水平。
2、本專利技術(shù)的技術(shù)方案包括：
3、一方面，本專利技術(shù)提供了一種小核酸組合物，所述的小核酸組合物為aso133/7/142/30，具有如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。
4、具體地，所述的小核酸組合物能干擾mirna，阻止mirna與靶mrna結(jié)合。
5、優(yōu)選地，所述的靶mrna為atp2a2。
6、具體地，所述的小核酸組合物將多個mirna種子序列的反義寡核苷酸片段通過鏈接子連接。
7、優(yōu)選地，所述的鏈接子具有如cccag所示的核苷酸序列。
8、優(yōu)選地，所述的mirna種子序列為mir-133、let-7、mir-142-3p和mir-30的種子序列。
9、進一步優(yōu)選地，所述的mirna種子序列的反義寡核苷酸片段具有如seq?id?no.2-5所示的核苷酸序列。
10、再進一步優(yōu)選地，所述的mir-133的反義寡核苷酸片段具有如seq?id?no.2所示的核苷酸序列。
11、再進一步優(yōu)選地，所述的let-7的反義寡核苷酸片段具有如seq?id?no.3所示的核苷酸序列。
12、再進一步優(yōu)選地，所述的mir-142-3p的反義寡核苷酸片段具有如seq?id?本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種小核酸組合物，其特征在于，所述的小核酸組合物為ASO133/7/142/30，具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的小核酸組合物將多個miRNA種子序列的反義寡核苷酸片段通過鏈接子連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的鏈接子具有如CCCAG所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的miRNA種子序列為miR-133、let-7、miR-142-3p和miR-30的種子序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的miRNA種子序列的反義寡核苷酸片段具有如SEQ?ID?NO.2-5所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的miRNA種子序列中miR-133的反義寡核苷酸片段具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列；let-7的反義寡核苷酸片段具有如SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列；miR-142-3p的反義寡核苷酸片段具有如SEQ
7.權(quán)利要求1-6任一項所述的小核酸組合物在制備預(yù)防、治療、輔助治療或預(yù)后治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的心血管疾病包括急性心肌梗死、心肌肥厚、心力衰竭或糖尿病心肌病。
9.一種預(yù)防、治療、輔助治療或預(yù)后治療心血管疾病的藥物，其特征在于，所述的藥物包含權(quán)利要求1-6任一項所述的小核酸組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于，所述的藥物還包括藥物上可接受的載體或賦形劑。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種小核酸組合物，其特征在于，所述的小核酸組合物為aso133/7/142/30，具有如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的小核酸組合物將多個mirna種子序列的反義寡核苷酸片段通過鏈接子連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的鏈接子具有如cccag所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的mirna種子序列為mir-133、let-7、mir-142-3p和mir-30的種子序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的mirna種子序列的反義寡核苷酸片段具有如seq?id?no.2-5所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核酸組合物，其特征在于，所述的mirna種子序列中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：白云龍，楊寶峰，王志國，呂延杰，張巍，
申請(專利權(quán))人：廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣州中醫(yī)藥研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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