【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及受體蛋白激動劑的檢測，具體涉及一種工程化細胞及其構建方法與其在檢測或篩選tlr4受體激動劑中的應用。
技術介紹
1、公開該
技術介紹
部分的信息僅僅旨在增加對本專利技術的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
2、toll樣受體4（toll?receptor?4,?tlr4）受體激動劑可以調節機體的免疫功能，起到促進免疫反應、抗感染、促進免疫記憶等多種作用。其中，tlr4受體激動劑激活抗原遞呈細胞（antigen?presenting?cell,?apc）這一作用使得其有望被開發成為免疫佐劑，因為apc的激活可以促進抗原遞呈，進而增強機體產生針對抗原的特異性免疫反應。免疫佐劑是疫苗的關鍵組成部分，可以增強疫苗免疫反應的強度、速度和持久性。根據其作用機制，佐劑通常分為免疫刺激分子、遞送系統或兩者的組合。免疫刺激分子主要通過激活先天免疫受體（例如tlr）來發揮作用，受體激活后會產生啟動下游適應性免疫反應的信號。為了引發對特定病原體的免疫反應，疫苗需要新型高效并安全的佐劑，其中，tlr4受體激動劑是非常有開發前景的佐劑。但是，目前缺乏對tlr4受體激動劑的高效篩選方法，從而大大限制了該類佐劑的開發。
技術實現思路
1、為了解決現有技術的不足，本專利技術的目的是提供一種工程化細胞及其構建方法與其在檢測或篩選tlr4受體激動劑中的應用，本專利技術提供的工程化細胞高表達帶有eyfp標簽的tlr4、
2、為了實現上述目的，本專利技術的技術方案為：
3、第一方面，一種工程化細胞，由含有帶有eyfp標簽的tlr4基因的慢病毒、含有帶有ecfp標簽的tlr4基因的慢病毒和含有md2-cd14基因的慢病毒轉染至hek293t細胞而得到的能夠高表達帶有eyfp標簽的tlr4、帶有ecfp標簽的tlr4、md2及cd14的hek293t細胞。hek293t細胞為人胚胎腎細胞，其極少表達細胞外配體所需的內生受體，比較容易轉染且轉染效率較高，是一個很常用的表達研究外源基因的工具細胞株。
4、本專利技術提供的工程化細胞能夠高表達帶有eyfp標簽的tlr4、帶有ecfp標簽的tlr4、md2及cd14，在tlr4受體激動劑存在的條件下，能夠在于cd14（白細胞分化抗原）和md2（骨髓分化蛋白2）的幫助下與tlr4相互作用并激活tlr4，從而使tlr4發生受體二聚化；由于本專利技術提供的工程化細胞表達的tlr4分別帶有eyfp和ecfp，tlr4發生受體二聚化后，使得eyfp和ecfp之間的距離拉近，使得兩個熒光蛋白的熒光基團距離小于10?nm，由此基團間的能量通過偶極-偶極耦合以非輻射方式從供體轉移到受體，從而產生熒光共振能量轉移（fret），進而通過fret實現tlr4受體激動劑的篩選。
5、為了獲得上述工程化細胞，本專利技術另一方面，提供一種上述工程化細胞的構建方法，包括如下步驟：
6、將含有帶有eyfp標簽的tlr4基因的慢病毒轉染至hek293t細胞獲得轉化細胞；
7、將含有帶有ecfp標簽的tlr4基因的慢病毒和含有md2-cd14基因的慢病毒轉染至所述轉化細胞。
8、首先，為了使hek293t細胞高表達帶有eyfp標簽的tlr4、帶有ecfp標簽的tlr4、md2及cd14，一般方法是轉染帶有相關基因的慢病毒，而對于本專利技術構建的工程化細胞來說，由于tlr4分別需要才有eyfp標簽和ecfp標簽，其基因的分子量較大，采用一個慢病毒同時攜帶三種相關基因難以成功轉染獲得相關工程化細胞，因此本專利技術采用三種慢病毒分別攜帶帶有eyfp標簽的tlr4基因、帶有ecfp標簽的tlr4基因、md2-cd14基因。
9、在轉染三種慢病毒的過程中，其轉染步驟可以同時轉染三種慢病毒，也可以分別依次轉染三種慢病毒。然而，本專利技術研究發現，同時轉染三種慢病毒會導致細胞產生缺陷，從而導致細胞錯誤識別或被污染，進而影響篩選tlr4受體激動劑的結果的準確性和可靠性；分別依次轉染三種慢病毒，則難以轉染獲得目標的工程化細胞。經過本專利技術的進一步研究意外發現，當采用本專利技術提供的上述步驟轉染（即先轉染含有帶有eyfp標簽的tlr4基因的慢病毒，再同時轉染含有帶有ecfp標簽的tlr4基因的慢病毒和含有md2-cd14基因的慢病毒）時，可以獲得目標的工程化細胞。
10、在一些實施方案中，轉染的hek293t細胞處于對數生長期內。因為在這個生長階段，細胞分裂和增殖速度最快，適合進行一系列的實驗和研究。對數生長期的細胞生長速率恒定，細胞密度增加迅速，并且細胞形態和生物化學特性比較穩定，這對于研究細胞的功能和特性非常重要。
11、在一些實施方案中，包括篩選過程，篩選過程中采用的培養基含有殺稻瘟菌素（blasticidin，bsd）、遺傳霉素（geneticin，g418）和嘌呤霉素（puromycin，puro）。
12、具體地，培養基中殺稻瘟菌素的濃度為45~55?μg/ml。
13、具體地，培養基中遺傳霉素的濃度為360~440?μg/ml。
14、具體地，培養基中嘌呤霉素的濃度為0.9~1.1?μg/ml。
15、第三方面，一種上述工程化細胞在檢測或篩選tlr4受體激動劑中的應用。
16、具體地，檢測或篩選的方法為：將待測樣品或待篩選樣品與所述工程化細胞進行孵育，然后進行熒光檢測。
17、在一些實施方案中，以lps為陽性對照。脂多糖（lipopolysaccharide，lps）是一種典型的tlr4配體，能夠被tlr4識別，lps與脂多糖結合蛋白（lbp）結合并形成復合物，該復合物能夠在cd14（lps受體，白細胞分化抗原）和md2（骨髓分化蛋白2）的幫助下與tlr4相互作用并激活tlr4，從而使tlr4發生受體二聚化。因此，lps可以作為檢測或篩選tlr4受體激動劑的陽性對照。
18、在一些實施方案中，使用流式細胞術進行熒光檢測。其中，熒光檢測的激發波長為404~407?nm，熒光檢測的發射波長為524~526?nm。
19、在一些實施方案中，孵育時間為8~10?h。
20、本專利技術的有益效果為：
21、本專利技術通過構建一種工程化細胞，利用fret原理實現在細胞水平上篩選能誘導tlr4二聚化的激動劑，從而為tlr4受體激動劑搭建篩選平臺，進而為新型免疫佐劑的研發提供豐富的物質基礎。
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1.一種工程化細胞，其特征是，由含有帶有EYFP標簽的TLR4基因的慢病毒、含有帶有ECFP標簽的TLR4基因的慢病毒和含有MD2-CD14基因的慢病毒轉染至HEK293T細胞而得到的能夠高表達帶有EYFP標簽的TLR4、帶有ECFP標簽的TLR4、MD2及CD14的HEK293T細胞。
2.一種權利要求1所述的工程化細胞的構建方法，其特征是，包括如下步驟：
3.如權利要求2所述的構建方法，其特征是，轉染的HEK293T細胞處于對數生長期內。
4.如權利要求2所述的構建方法，其特征是，包括篩選過程，篩選過程中采用的培養基含有殺稻瘟菌素、遺傳霉素和嘌呤霉素。
5.如權利要求4所述的構建方法，其特征是，培養基中殺稻瘟菌素的濃度為45~55?μg/mL；
6.一種權利要求1所述的工程化細胞在檢測或篩選TLR4受體激動劑中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征是，檢測或篩選的方法為：將待測樣品或待篩選樣品與所述工程化細胞進行孵育，然后進行熒光檢測。
8.如權利要求7所述的應用，其特征是，以LPS為陽
9.如權利要求7所述的應用，其特征是，使用流式細胞術進行熒光檢測。
10.如權利要求7所述的應用，其特征是，孵育時間為8~10?h。
...【技術特征摘要】
1.一種工程化細胞，其特征是，由含有帶有eyfp標簽的tlr4基因的慢病毒、含有帶有ecfp標簽的tlr4基因的慢病毒和含有md2-cd14基因的慢病毒轉染至hek293t細胞而得到的能夠高表達帶有eyfp標簽的tlr4、帶有ecfp標簽的tlr4、md2及cd14的hek293t細胞。
2.一種權利要求1所述的工程化細胞的構建方法，其特征是，包括如下步驟：
3.如權利要求2所述的構建方法，其特征是，轉染的hek293t細胞處于對數生長期內。
4.如權利要求2所述的構建方法，其特征是，包括篩選過程，篩選過程中采用的培養基含有殺稻瘟菌素、遺...
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