【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其是一種納米金剛石陣列制備及mirna超靈敏檢測方法。
技術(shù)介紹
1、蛋白、核酸等生物分子的動態(tài)檢測已逐漸發(fā)展為惡性腫瘤(癌癥)早期診斷、監(jiān)測和預(yù)后判斷的新趨勢。其中，人體血清、唾液等體液中mirna的表達在癌癥發(fā)生和演進過程中具有顯著的量化關(guān)系。目前，基于熒光、電化學、比色原理的mirna檢測存在檢測周期長、檢測限低、特異性較差、檢測環(huán)境苛刻等若干不足，因此，迫切需要改善現(xiàn)有癌癥早期診斷方法并開拓檢測原理創(chuàng)新以實現(xiàn)低豐度mirna的超靈敏測量。氮空位中心(nv色心)是金剛石原子結(jié)構(gòu)中的一種發(fā)光缺陷，其包含一個取代了碳原子的氮原子和一個空穴，金剛石nv色心的能級結(jié)構(gòu)顯示其基態(tài)與激發(fā)態(tài)均是自旋三態(tài)。室溫下，金剛石nv色心的零聲子線位于637nm附近，在680nm處熒光最強，吸收最強則處于綠光波段。通過對nv色心施加磁場和寬頻微波，nv色心自旋態(tài)對磁場具有快速響應(yīng)特性并表現(xiàn)為熒光強度的變化。同時金剛石nv色心因其高穩(wěn)定性、低細胞毒性，適用于生物分子的電磁場測量。
2、現(xiàn)有技術(shù)中，中國專利技術(shù)專利“申請?zhí)枺?02010224841.6”公開了一種基于金剛石nv色心的掃描探測系統(tǒng)，提高了nv色心的光子收集效率，但無法實現(xiàn)大面積和快速樣品掃描，因此在體外mirna的高通量及快速檢測應(yīng)用中存在顯著局限性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、專利技術(shù)目的：本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種納米金剛石陣列的制備及超靈敏mirna檢測方法，將磁納米標簽定向分布到按一定間
2、技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種納米金剛石陣列制備及mirna超靈敏檢測方法，包括：
3、步驟一、準備硅片并用丙酮、無水乙醇和去離子水進行超聲清洗；
4、步驟二、在超聲清洗后的硅片表面熱蒸鍍金薄膜；
5、步驟三、在硅片表面的金薄膜上自組裝排列緊密的單層ps微球陣列；包括：
6、(a)取300～500μl質(zhì)量分數(shù)5％～10％，粒徑為0.5～3μm的ps微球水懸浮液和等體積無水乙醇混合并超聲分散均勻；
7、(b)丙酮、無水乙醇和去離子水對硅片進行超聲清洗，干燥后等離子處理1～3分鐘；
8、(c)取3～10μlps微球/乙醇分散液于等離子處理后的硅片表面，在勻膠機上以500～1000轉(zhuǎn)每分鐘轉(zhuǎn)速旋涂10～30秒；干燥后緩慢浸沒至含10％～30％乙醇的水溶液中，單層據(jù)苯乙烯微球薄膜懸浮在液體表面；
9、(d)將表面鍍有金薄膜的硅片浸沒至溶液，靠近ps微球薄膜后將其緩慢抽離液體，液面上的ps微球轉(zhuǎn)移至硅片。
10、步驟四、通過反應(yīng)離子刻蝕工藝對排列緊密的ps微球陣列進行刻蝕，其中氧氣流量為10～50sccm，射頻功率為10～50mw，真空度為0.1～0.5mtorr，刻蝕時間為5～30分鐘。
11、步驟五、在步驟四制備的樣品表面熱蒸鍍20～100nm鋁薄膜；之后將樣品置于無水乙醇中并進行超聲處理去除ps微球，得到暴露金薄膜的微孔陣列；
12、步驟六、采用濃硫酸和硝酸對平均粒徑為40～750nm且含nv色心的納米金剛石表面進行酸洗；
13、步驟七、在酸洗后的納米金剛石表面修飾dna探針：取100～500μl酸洗后的熒光納米金剛石于離心管，隨后加入10～50μl的edc水溶液和10～50μlnhs水溶液；搖勻后加入1～5nmol且兩端分別修飾氨基和巰基的dna探針并再室溫下孵育過夜。
14、步驟八、將表面修飾探針的納米金剛石滴加到微孔陣列表面，孵室溫育后浸沒在3％吐溫-20溶液中清洗10～30分鐘清洗處理以去除未和金薄膜連接的納米金剛石，干燥后得到平均粒徑為40～750nm的納米金剛石陣列。
15、本專利技術(shù)還提供一種納米金剛石陣列mirna超靈敏檢測方法，包括以下步驟：
16、取1～5nmol末端修飾氨基的探針dna、2～10mg?edc、2～10mg?nhs加入至100～500μl濃度為1nmol/ml且表面含羧基的磁球溶液中，并在室溫下孵育過夜；使用緩沖液離心洗滌孵育好的溶液以去除未連接牢固的探針dna，得到dna探針磁球溶液；取10μl目標mirna溶液與100～500μl?dna探針磁球溶液混勻后孵育，用緩沖液離心洗滌以去除未反應(yīng)的mirna，得到目標mirna偶聯(lián)磁球。將目標mirna偶聯(lián)的探針磁球滴加到納米金剛石陣列表面孵育，然后使用掃描系統(tǒng)、微波模塊和光路系統(tǒng)對納米金剛石陣列表面的目標mirna偶聯(lián)磁球進行掃描定位并采集光探測磁共振譜。
17、其中，所述微波系統(tǒng)包括微波發(fā)生器和微波天線，所述光路系統(tǒng)包括：激光器、單光子計數(shù)器、奧林巴斯倒置顯微鏡和二色向鏡。所屬掃描系統(tǒng)包括：壓電式掃描載物臺。
18、如圖2所示，偶聯(lián)目標mirna的磁球通過堿基互補配對和納米金剛石陣列連接；激光器發(fā)出532nm激光，經(jīng)二色向鏡和奧林巴斯顯微鏡的光路系統(tǒng)傳輸?shù)郊{米金剛石陣列表面，同時微波源將2.7～2.95ghz微波傳輸至微波天線以對納米金剛石內(nèi)部的氮空位色心進行能級調(diào)控，氮空位色心在532nm激光激發(fā)下產(chǎn)生熒光，并且當外界磁場存在時，2.87ghz頻率下的熒光發(fā)生衰減，光子信號由奧林巴斯倒置顯微鏡光路系統(tǒng)和二色向鏡傳輸至單光子計數(shù)模塊得到一個坐標位置的光探測磁共振譜，通過壓電位移臺掃描可得到樣品不同位置的光探測磁共振譜。根據(jù)每個坐標點光探測磁共振譜中2.87ghz熒光變化可確定mirna偶聯(lián)磁球的位置，實現(xiàn)mirna、超靈敏檢測。
19、有益效果：(1)本專利技術(shù)的納米金剛石陣列采用自組裝工藝，相比于采用半導體微納加工工藝直接在塊狀金剛石表面刻蝕柱狀陣列結(jié)構(gòu)，具有工藝簡單、無需精密光刻設(shè)備的優(yōu)勢；(2)該納米金剛石陣列具有較大的間距，有利于增加壓電位移臺的步進掃描距離，從而提升對生物樣本的檢測速度；(3)本專利技術(shù)的納米金剛石陣列mirna檢測方法采集生物樣本中磁標簽引起的熒光變化率，相比于直接采集熒光信號，可以有效隔離基底材料的背景熒光，從而提高信噪比。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護點】
1.一種納米金剛石陣列制備方法，其特征在于包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(2)中自組裝排列緊密的單層聚苯乙烯微球陣列的制備方法包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(3)中PS微球陣列的制備方法包括以下步驟：通過反應(yīng)離子刻蝕系統(tǒng)將硅片表面的單層PS微球的粒徑減小，其中氧氣流量為10～50sccm，射頻功率為10～50mW，真空度為0.1～0.5mTorr，刻蝕時間為5～30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述納米金剛石內(nèi)部含有氮空位色心，平均粒徑為40nm～750nm，所述預(yù)處理包括：采用濃硫酸和硝酸對納米金剛石進行酸洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(5)中納米金剛石表面修飾DNA探針包括以下步驟：取100～500μL酸洗的納米金剛石，分別加入10～50μL的EDC溶液和NHS溶液，搖勻后加入1～5nmol?DNA探針，其中DNA探針5’端修飾氨基，3’端修
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟八中所述清洗處理包括：置于3％的吐溫-20溶液中浸沒10～30分鐘。
7.一種納米金剛石陣列miRNA超靈敏檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：制備目標miRNA偶聯(lián)的探針磁球，并滴加到納米金剛石陣列表面孵育，然后使用掃描系統(tǒng)、微波模塊和光路系統(tǒng)對納米金剛石陣列表面的目標miRNA偶聯(lián)磁球進行掃描定位及信號檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米金剛石陣列miRNA超靈敏檢測方法，其特征在于：所述微波系統(tǒng)包括微波發(fā)生器和微波天線，所述光路系統(tǒng)包括：激光器、單光子計數(shù)器、奧林巴斯倒置顯微鏡和二色向鏡；所屬掃描系統(tǒng)包括：壓電式掃描載物臺；所檢測信號為光探測磁共振譜。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米金剛石陣列miRNA超靈敏檢測方法，其特征在于，制備目標miRNA偶聯(lián)的探針磁球；包括以下步驟：取1～5nmol探針DNA溶液、2～10mg?EDC、2～10mgNHS加入至100～500μL濃度為1nmol/mL且表面含羧基的磁球溶液中，并在室溫下孵育過夜；使用緩沖液離心洗滌孵育好的溶液以去除未連接牢固的探針DNA，得到DNA探針磁球溶液；取10～50μL目標miRNA溶液與100～500μL?DNA探針磁球溶液混勻后孵育，用緩沖液離心洗滌以去除未反應(yīng)的miRNA，得到目標miRNA偶聯(lián)磁球；所述探針DNA末端修飾有氨基。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種納米金剛石陣列制備方法，其特征在于包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(2)中自組裝排列緊密的單層聚苯乙烯微球陣列的制備方法包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(3)中ps微球陣列的制備方法包括以下步驟：通過反應(yīng)離子刻蝕系統(tǒng)將硅片表面的單層ps微球的粒徑減小，其中氧氣流量為10～50sccm，射頻功率為10～50mw，真空度為0.1～0.5mtorr，刻蝕時間為5～30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述納米金剛石內(nèi)部含有氮空位色心，平均粒徑為40nm～750nm，所述預(yù)處理包括：采用濃硫酸和硝酸對納米金剛石進行酸洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟(5)中納米金剛石表面修飾dna探針包括以下步驟：取100～500μl酸洗的納米金剛石，分別加入10～50μl的edc溶液和nhs溶液，搖勻后加入1～5nmol?dna探針，其中dna探針5’端修飾氨基，3’端修飾巰基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金剛石陣列制備方法，其特征在于，步驟八中所述清洗處理包括：置于3％的吐溫-2...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉磊，邢佑強，衷吉新，吳澤，黃鵬，李冰玨，
申請(專利權(quán))人：東南大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。