【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物學檢測，具體涉及一種常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法。
技術介紹
1、近年來，隨著全球范圍內抗生素的過度使用，越來越多的致病菌對目前常用的抗生素產生了耐藥性，耐藥細菌在臨床分離株中的檢出率日益增高。細菌獲得耐藥性的主要機制是產生能夠分解抗生素的酶，此外，部分細菌還可以通過編碼孔蛋白基因(如oprd)的缺失或突變、外排泵基因的過表達或青霉素結合蛋白(pbp)結合力下降以及形成生物膜等其它非特異性機制來獲得耐藥性。耐藥菌的感染更難治療且死亡率更高，對公共衛生安全和臨床治療構成了嚴重威脅。
2、耐藥菌的傳播嚴重威脅著人類生命健康安全，建立快速、準確的檢測方法對其進行有效的檢測迫在眉睫。目前，耐藥細菌的檢測方法主要分為表型檢測和分子檢測兩大類。表型檢測方法操作簡單，成本較低，不需要高超的技術水平和大型設備，但是檢測耗時較長。分子檢測具有極高的特異性和敏感性，能夠在短時間內完成檢測，但是只能對特定的基因進行檢測，并不能對其它基因和新出現的基因進行檢測，且分子檢測結果可能與表型檢測結果不相符。綜上，表型檢測和分子檢測在臨床診斷上有著或多或少的不足。
3、實時熒光定量pcr技術(quantitativereal-timepcr)是一種在dna擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應(pcr)循環后產物總量的方法?；诟哽`敏度、重復性和準確性等優點，qpcr技術目前已經廣泛應用于基因檢測領域，被譽為核酸分子檢測的“金標準”。
4、本專利技術建立了一種表型檢測方法和分子檢測相結合的
技術實現思路
1、本專利技術解決的技術問題是提供了一種常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，該方法針對現有耐藥細菌表型檢測方法和分子檢測方法的不足，建立一種將表型檢測方法和分子檢測方法相結合的檢測方法，能夠快速確定待測致病菌是否對所用的抗生素耐藥以及其具體的菌種。既彌補了表型檢測用時過長且只能對產抗生素分解酶這一種耐藥機制進行檢測的缺點，同時結合分子檢測的“金標準”-pcr技術能夠對待測菌的具體菌種進行檢測。因此，本專利技術成功建立了一種操作簡單、價格低廉且檢測特異性高和靈敏度高的致病細菌檢測方法。
2、本專利技術為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，將表型檢測方法和分子檢測方法相結合，其具體步驟為：
3、步驟s1：進行表型檢測，將待測細菌分別放入有抗生素培養基和無抗生素培養基中進行培養；
4、步驟s2：分別提取培養菌液待測細菌基因組dna；
5、步驟s3：進行分子檢測，對待測細菌基因組dna進行qpcr檢測；
6、步驟s4：對檢測數據進行分析，采用如下判定方法判斷待測細菌的具體菌種以及是否對培養基中加入的抗生素耐藥：若只有在無抗生素培養基中培養的待測細菌檢測到的ct值<35，而在有抗生素培養基中培養的待測細菌檢測到的ct值≥35或檢測不出ct值，則說明檢測到特定致病細菌且該特定致病細菌對培養基中相應的抗生素沒有耐藥性；若在有抗生素培養基和無抗生素培養基中分別培養的待測細菌檢測到的ct值均<35，則說明檢測到特定致病細菌且該特定致病細菌對培養基中相應的抗生素具有耐藥性；若在有抗生素培養基和無抗生素培養基中分別培養的待測細菌檢測到的ct值均≥35或檢測不出ct值，則說明沒有檢測到特定致病菌。
7、優選的，步驟s1中所述表型檢測的具體過程為：將待測細菌分別放入有抗生素液體培養基和無抗生素液體培養基中，在37℃、180rpm的條件下培養2-3h后吸取少量菌液轉接到新的相同培養基中接著在37℃、180rpm的條件下培養2-3h。在培養2-3h時將待測細菌轉接到新的培養基中的目的是對待測細菌是否耐藥進行二次篩選，避免假陽性的產生；利用抗生素能夠對待測細菌是否耐藥進行篩選，具有耐藥性的待測細菌在抗生素液體培養基和無抗生素液體培養基中均能生長，而無耐藥性的待測細菌只能在無抗生素液體培養基中生長。
8、優選的，步驟s1中所述有抗生素液體培養基中抗生素的濃度為其最低抑菌濃度。
9、優選的，步驟s2中所述待測細菌基因組dna的提取方法采用水煮法，其具體過程為：取1ml培養后的培養菌液在9000rpm的條件下離心1min后倒去上清液，再加入100μl?te緩沖液并于100℃煮沸10min后迅速放于-20℃冰箱冷凍10min，在12000rpm的條件下離心5min，上清液即為所需待測細菌基因組dna。
10、優選的，步驟s1中所述待測細菌為肺炎克雷伯菌(kp)、銅綠假單胞菌(pa)、鮑曼不動桿菌(ab)、陰溝腸桿菌(ecl)或大腸桿菌(ec)中的一種或多種；qpcr檢測所用引物如下：seq?id?no:1-2為檢測肺炎克雷伯菌的引物對序列；seq?id?no:3-4為檢測銅綠假單胞菌的引物對序列；seq?id?no:5-6為檢測鮑曼不動桿菌的引物對序列；seq?id?no:7-8為檢測陰溝腸桿菌的引物對序列；seq?id?no:9-10為檢測大腸桿菌的引物對序列。
11、優選的，步驟s3中所述qpcr檢測體系組成為：10μm正向引物0.4μl、10μm反向引物0.4μl、ddh2o?7.2μl、2×ultrasybr?mixture?10μl(康為世紀)和待測細菌基因組dna?2μl；qpcr反應程序為：95℃，600s，循環1次；95℃，10s、60℃，30s、72℃，32s采集熒光信號，循環40次。
12、與現有技術相比，本專利技術具有以下優點和有益效果：
13、1.本專利技術建立了一種表型檢測方法和分子檢測方法結合的檢測方法，利用抗生素對致病細菌是否耐藥進行篩選，能夠對耐藥細菌所有的耐藥機制進行檢測，彌補了大多數表型檢測方法只能對產抗生素分解酶這一種耐藥機制進行檢測的缺點。在分子檢測中采用qpcr技術能夠確定致病細菌具體的菌種。將表型檢測方法同分子檢測方法相結合，建立了一種檢測周期短、特異性強、靈敏度高、操作簡單的新型檢測方法。
14、2.表型檢測中，在搖菌2-3h后將待測菌轉接到新的培養基中，目的是用抗生素對待測菌是否耐藥進行二次篩選，避免耐藥假陽性的出現。
15、3.采用水煮法提取待測細菌基因組dna，簡化了操作步驟的同時大大節省了檢測的時間和成本。
16、4.在分子檢測中，通過對引物、引物濃度、反應程序、反應體系等進行優化，建立特異性強、靈敏度高、重復性好的qpcr檢測方法。
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1.一種常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：將表型檢測方法和分子檢測方法相結合，其具體步驟為：
2.根據權利要求1所述的常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：步驟S1中所述表型檢測的具體過程為：將待測細菌分別放入有抗生素液體培養基和無抗生素液體培養基中，在37℃、180rpm的條件下培養2-3h后吸取少量菌液轉接到新的相同培養基中接著在37℃、180rpm的條件下培養2-3h。
3.根據權利要求2所述的常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：步驟S1中所述有抗生素液體培養基中抗生素的濃度為其最低抑菌濃度。
4.?根據權利要求1所述的常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：步驟S2中所述待測細菌基因組DNA的提取方法采用水煮法，其具體過程為：取1mL培養后的培養菌液在9000rpm的條件下離心1min后倒去上清液，再加入100μL?TE緩沖液并于100℃煮沸10min后迅速放于-20℃冰箱冷凍10min，在12000rpm的條件下離心5min，上清液即為所需待測細菌基因組DNA。
5.?根
6.?根據權利要求1所述的常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：步驟S3中所述qPCR檢測體系組成為：10μM正向引物0.4μL、10μM反向引物0.4μL、ddH2O?7.2μL、2×UltraSYBR?Mixture?10μL和待測細菌基因組DNA?2μL；qPCR反應程序為：95℃，600s，循環1次；95℃，10s、60℃，30s、72℃，32s采集熒光信號，循環40次。
...【技術特征摘要】
1.一種常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：將表型檢測方法和分子檢測方法相結合，其具體步驟為：
2.根據權利要求1所述的常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：步驟s1中所述表型檢測的具體過程為：將待測細菌分別放入有抗生素液體培養基和無抗生素液體培養基中，在37℃、180rpm的條件下培養2-3h后吸取少量菌液轉接到新的相同培養基中接著在37℃、180rpm的條件下培養2-3h。
3.根據權利要求2所述的常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：步驟s1中所述有抗生素液體培養基中抗生素的濃度為其最低抑菌濃度。
4.?根據權利要求1所述的常見致病細菌及其耐藥性的快速檢測方法，其特征在于：步驟s2中所述待測細菌基因組dna的提取方法采用水煮法，其具體過程為：取1ml培養后的培養菌液在9000rpm的條件下離心1min后倒去上清液，再加入100μl?te緩沖液并于100℃煮沸10min后迅速放于-20℃冰箱冷凍10min，在12000rpm的條件下離心5min，上清液...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王強，陳建軍，孫韋地，謝龍旭，
申請(專利權)人：河南師范大學，
類型：發明
國別省市：
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