【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及胃癌相關基因信號通路的挖掘與應用，具體涉及胃癌免疫治療(ici)響應性靶向細胞的鑒定與分離。
技術介紹
1、胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，最新的研究顯示，其發病率和死亡率均位于第五位。過去幾十年里，化療在胃癌治療中的基石作用依舊難以撼動。但無論化療方案如何更迭，晚期胃癌患者生存期始終不能讓人滿意。2010年，toga研究將胃癌的治療方法帶入靶向時代，但靶向治療只能為特定亞型患者帶來獲益。隨著分子生物學的蓬勃發展，免疫系統與腫瘤之間存在的微妙關系被逐漸揭開。ctla-4和pd-1/pd-l1等免疫檢查點在腫瘤免疫逃逸中的作用被發現，為腫瘤的治療提供了新的靶點。比如，pd-1/pd-l1抑制劑通過阻斷pd-1與pd-l1的結合，恢復t細胞的抗腫瘤活性，顯著延長了部分胃癌患者的生存期。
2、由于腫瘤的異質性，pd-1治療的效果在不同患者之間表現出了顯著差異性。腫瘤微環境(tumor?microenvironment,tme)由多種細胞類型組成，包括癌細胞、成纖維細胞、內皮細胞和各種免疫細胞。這些細胞與周圍系統之間復雜、動態的相互作用使腫瘤微環境具有極大的異質性。腫瘤的微環境特征通常會與免疫檢查點抑制劑的治療響應有關，比如在腫瘤微環境中pd-l1的表達與胃癌的抗pd-1/pd-l1療法的療效相關。另外，腫瘤微環境也有可能會限制效應t細胞對腫瘤細胞的滲入，從而減弱t細胞的擴張，或直接降低浸潤淋巴細胞(tumor?infiltrating?lymphocytes，tils)的存活力。
4、單細胞測序技術(single?cell?sequencing)能夠在單個細胞水平上對基因組、轉錄組、表觀組等遺傳信息進行高通量測序分析。與傳統的組織樣本測序相比，單細胞測序技術能夠捕獲不同發育時間下不同機體組織、不同類型的細胞，并且揭示每個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映混雜樣品測序所無法得到的異質性信息和稀有細胞的遺傳信息。單細胞測序技術在腫瘤微環境研究中發揮著至關重要的作用。單細胞測序技術能夠揭示單個細胞的基因表達譜和遺傳變異，從而幫助人們更好地理解腫瘤微環境的異質性。比如，hir?oyoshi?nishikawa教授從代謝角度研究tme中表達pd-1的效應t細胞和調節性t細胞(reg?ulatory?t?cells，tregs)間穩態平衡的影響因素，發現乳酸能夠作為treg細胞的代謝檢查點并控制tme中的免疫反應，影響pd-1阻斷的效率。然而，乳酸這一代謝物在腫瘤微環境中的作用機制頗為復雜，它不僅牽涉到t細胞的代謝重編程，還可能對其他免疫細胞的功能以及腫瘤細胞的生長產生影響。這種錯綜復雜的機制使得乳酸與免疫治療響應性之間的直接因果關系難以明確界定。同時乳酸作為單一標志物，在全面反映胃癌免疫治療的復雜性方面可能存在局限，為了更精準地評估免疫治療的預期效果，乳酸標志物可能需要與其他多種生物標志物(如pd-l1表達水平、腫瘤突變負荷等)聯合使用。
5、鑒于對于免疫檢查點抑制劑通過介導免疫激活來調節腫瘤的突變分布和影響腫瘤微環境的機理仍然知之甚少，以及腫瘤免疫治療的響應性往往受到多重因素的共同影響，包括腫瘤細胞的遺傳特性、免疫細胞的浸潤狀況、腫瘤微環境的代謝狀態，而且這些都在一定程度上影響了對胃癌免疫治療響應性調控的分子標志物的研究與揭示，導致目前在臨床上缺乏有效的輔助手段來評估胃癌免疫治療的預期效果，尤其是仍缺乏在胃癌中用于指導免疫治療響應預測及用藥選擇的可靠、普適的生物標志物，從而加重了患者治療負擔。因此亟待從腫瘤微環境中分離并鑒定與胃癌免疫治療響應相關的靶向細胞。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種面向pd-1治療響應性的胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法。
2、為達到上述目的，本專利技術采用了以下技術方案：
3、第一方面，提供一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，該靶向細胞富集包括以下步驟：
4、步驟1樣本準備
5、將胃癌患者腫瘤組織樣本切割成2～4毫米的組織碎塊；
6、步驟2組織消化
7、將組織碎塊切成碎片；將組織碎片用pbs或生理鹽水清洗，然后用胰蛋白酶孵育15～48小時；
8、步驟3細胞懸液制備
9、消化完成后分散細胞；使用細胞篩過濾得到細胞懸液；將細胞沉降分離后用緩沖液洗滌細胞；在培養基中重懸細胞；
10、步驟4流式細胞分選
11、使用流式細胞儀的熒光標記功能，對細胞進行標記；將細胞懸液通過流式細胞儀進行分選，分別獲得肥大細胞和內皮細胞；
12、步驟5細胞純度驗證
13、分選后的肥大細胞和內皮細胞分別通過流式細胞儀進行純度檢測，確保細胞群體的純度。
14、優選的，所述靶向細胞富集方法還包括以下步驟：
15、步驟6細胞培養
16、將分選出的肥大細胞和內皮細胞分別接種到培養基中進行培養。
17、優選的，所述靶向細胞富集方法還包括以下步驟：
18、步驟7細胞內源基因表達檢測
19、對于培養后的肥大細胞和/或內皮細胞，檢測相應細胞中vegfa和flt1基因的表達水平。
20、優選的，所述基因表達檢測的方法選自免疫組化、rna測序或蛋白質組學技術。
21、優選的，所述步驟1中，胃癌患者為接受≤7個pd-1周期(階段)治療的胃癌患者(含未接受過相關免疫治療的胃癌患者)。
22、優選的，所述腫瘤組織是在每次接受一階段的治療前對同一位胃癌患者進行活檢而獲得。
23、優選的，所述步驟4中，肥大細胞的標記(marker)基因為tpsab1和gata2，內皮細胞的標記(marker)基因為vwf和cd34，根據標記基因確定相應細胞的熒光標記物。通過流式細胞分選儀的精確分選功能，將表達tpsab1和gata2的細胞群體(肥大細胞)和表達vwf和cd34的細胞群體(內皮細胞)分別分選出來。
24、第二方面，提供分離自胃癌組織(胃癌腫瘤微環境)的肥大細胞和/或內皮細胞在制備藥物篩選制劑中的應用。
25、優選的，所述藥物選自vegfa-flt1通路抑制劑。
26、優選的，所述藥物選自免疫檢查點抑制劑。
27、本專利技術的有益效果體現本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：該靶向細胞富集包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述靶向細胞富集方法還包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述靶向細胞富集方法還包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述基因表達檢測的方法選自免疫組化、RNA測序或蛋白質組學技術。
5.根據權利要求1～4中任意一項所述的胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述步驟1中，胃癌患者為接受≤7個PD-1周期治療的胃癌患者。
6.根據權利要求5所述的胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述腫瘤組織是在每次接受一階段的治療前對同一位胃癌患者進行活檢而獲得。
7.根據權利要求1～4中任意一項所述的胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述步驟4中，肥大細胞的標記基因為TPSAB1和GATA2，內皮細胞的標記基因為VWF和CD
8.分離自胃癌組織的肥大細胞和/或內皮細胞在制備藥物篩選制劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述藥物選自VEGFA-FLT1通路抑制劑。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述藥物選自免疫檢查點抑制劑。
...【技術特征摘要】
1.一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：該靶向細胞富集包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述靶向細胞富集方法還包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述靶向細胞富集方法還包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述一種胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述基因表達檢測的方法選自免疫組化、rna測序或蛋白質組學技術。
5.根據權利要求1～4中任意一項所述的胃癌患者腫瘤微環境靶向細胞富集方法，其特征在于：所述步驟1中，胃癌患者為接受≤7個pd-1周期治療的胃癌患者。
<...【專利技術屬性】
技術研發人員：李紀鵬，喬一桓，康博禹，馮秀，樊小艷，王佳琳，
申請(專利權)人：中國人民解放軍空軍軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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