【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及體外檢測，尤其涉及一種人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法。
技術介紹
1、褪黑素(melatonin，mt)是由腦松果體分泌的激素之一。褪黑素屬于吲哚雜環類化合物，其化學名是n-乙酰基-5甲氧基色胺，又稱為松果體素、褪黑激素、褪黑色素。褪黑素的分泌具有明顯的晝夜節律，白天分泌受抑制，晚上分泌活躍。褪黑素可抑制下丘腦-垂體-性腺軸，使促性腺激素釋放激素、促性腺激素、黃體生成素以及卵泡刺激素的含量均減低，并可直接作用于性腺，降低雄激素、雌激素及孕激素的含量。另外，mt有強大的神經內分泌免疫調節活性和清除自由基抗氧化能力。雖然大多數人的內源性褪黑素即可滿足生理需要，但某些人可能缺乏生成適當褪黑激素的能力，此時外源補充褪黑素是相對安全的一種策略，因此血清mt水平是衡量人體內褪黑激素含量的參考指標。褪黑素在人體中血清濃度大概在白天下午4點最低，平均值是4.6pg/ml；早晨4點血清褪黑素水平最高，平均值為77.5pg/ml。
2、目前測定褪黑素的方法主要有酶聯免疫法和板式化學發光法，這兩種方法的檢測原理基本相同，都是將抗體包被在特定的包被板上，通過另一株標記抗體與被檢測物形成雙抗體夾心結構，通過od值計算相對濃度。這兩種檢測方法主要技術原理都是雙抗體夾心法，靈敏度及線性范圍等性能較低。
3、目前，針對褪黑素的試劑盒通常是采用液相色譜法的，例如專利cn202110651856.5公開的一種檢測血清中5-羥色胺和褪黑素濃度的試劑盒，實質采用超高效液相色譜串聯質譜技術檢測血清中5-羥色胺和褪黑素，試
4、因此急需改進測定褪黑素的方法，創新提出人褪黑素化學發光免疫檢測方法和試劑盒，使用簡單的試劑組成，不必使用昂貴的儀器和配備專業人員，降低成本，同時提高檢測靈敏度，拓展檢測線性范圍，提高穩定性。
技術實現思路
1、為解決上述現有問題，本專利技術公開了一種人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法，通過化學發光的方法進行檢測，對試劑盒中的試劑成分和制備原料進行了改進，選擇偶聯有對甲苯磺酰基的微球，使靈敏度達到1.05pg/ml，適合低濃度樣本的檢測；使用了含有海藻糖和亞氨基二琥珀酸四鈉的緩沖液保存磁珠包被的褪黑素抗原，提高保存過程中的穩定性，最長可在4℃下保存2年而不影響試劑盒的準確度和靈敏度；可通過封閉的試劑盒、儀器的檢測系統自動進行樣本分析檢測，減少系統誤差和消除人工操作引入的誤差，檢測效率高，應用前景廣闊。
2、一方面，本專利技術提供了一種人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，包括r1試劑和r2試劑，r1試劑包括磁珠包被的褪黑素抗原，r2試劑包括化學發光標記物標記的褪黑素抗體。
3、在一些方式中，所述磁珠包被的褪黑素抗原的磁珠上偶聯有官能團，所述官能團包括羧基、氨基和對甲苯磺酰基(tosyl)中的一種或多種。
4、優選的，所述磁珠包被的褪黑素抗原的磁珠上偶聯有對甲苯磺酰基。
5、從原理角度分析，官能團實際影響的是微球與待偶聯的分子之間的連接效率，不同的底物對微球不同官能團修飾有不同的效果，在本專利技術中，顯然褪黑素抗原適合使用tosyl微球進行包被，這是由褪黑素的分子結構決定的，這是本專利技術的重要發現之一。
6、在一些方式中，所述磁珠包被的褪黑素抗原中，磁珠與褪黑素抗原的質量比為1-5:100。
7、在一些方式中，所述化學發光標記物包括吖啶酯、魯米諾、異魯米諾和三聯吡啶釕中的一種或多種。
8、在一些方式中，所述化學發光標記物與褪黑素抗體的摩爾比為5-10:1。
9、在一些方式中，所述r1試劑還包括第一緩沖液，所述磁珠包被的褪黑素抗原保存于第一緩沖液，所述磁珠濃度為0.01-1wt％。
10、優選的，所述第一緩沖液包括100-500mm?bistris、0.05-0.1％吐溫-20和0.05-0.1％proclin300。
11、進一步優選的，所述第一緩沖液還包括海藻糖和亞氨基二琥珀酸四鈉。
12、從原理上分析，可能是微觀層面上亞氨基二琥珀酸離子、海藻糖在溶液中組成了類似網狀的排列，將tosyl微球和褪黑素抗原連接部分固定，起到促進穩定性的效果，具體原理待進一步論證；海藻糖和亞氨基二琥珀酸四鈉對提高磁珠包被褪黑素抗原的穩定性的協同效果是本專利技術的另一大重要發現。
13、進一步的研究發現，使用含有海藻糖和亞氨基二琥珀酸四鈉的第一緩沖液，可在40℃保存28天而維持光量子數沒有顯著上升，換算可知可在4℃下保存2年而不影響檢測的靈敏度和準確度。對于海藻糖的亞氨基二琥珀酸四鈉的濃度比例，經過試驗篩選，海藻糖含量在0.05-0.5mm為佳，亞氨基二琥珀酸四鈉含量在0.02-1mm為佳，最佳為0.1mm海藻糖、0.1mm亞氨基二琥珀酸四鈉。
14、在一些方式中，所述r2試劑還包括第二緩沖液，所述化學發光標記物標記的褪黑素抗體保存于第二緩沖液，所述化學發光標記物標記的褪黑素抗體的濃度為0.1-1μg/ml。
15、優選的，所述第二緩沖液包括100-500mm?bistris、0.05-0.1％吐溫-20和0.05-0.1％proclin300。
16、進一步優選的，所述第二緩沖液還包括兔igg、海藻糖和亞氨基二琥珀酸四鈉。
17、從原理上分析，可能是微觀層面上亞氨基二琥珀酸離子、海藻糖在溶液中組成了類似網狀的排列，兔igg網狀分布在體系中，更多的結合位點充分接觸血清中的干擾抗原，消除了非特異性結合，使檢測值穩定落于真實值的可接受誤差范圍內，檢測結果可信；兔igg、海藻糖和亞氨基二琥珀酸四鈉對消除褪黑素檢測中的非特異性結合的協同效果也是本專利技術的一大重要發現。
18、進一步的研究發現，兔igg含量在0.2-15μg/ml為佳，海藻糖含量在0.05-0.5mm為佳，亞氨基二琥珀酸四鈉含量在0.02-1mm為佳，最佳為5μg/ml兔igg、0.1mm海藻糖、0.1mm亞氨基二琥珀酸四鈉。
19、另一方面，本專利技術提供了一種人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括步驟：
20、步驟1、r1試劑的制備：
21、褪黑素抗原經過置換后，將磁珠與褪黑素抗原一起混懸過夜，加入封閉劑后集磁取上清，得到1-5％包被的褪黑素抗原的磁珠；接著在100-500mm?bistris、0.05-0.1％吐溫-20、0.05-0.1％?proclin300、ph6.0-8.0的緩沖液中配成磁珠濃度為質量比是0.01-1％的r1試劑；
22、步驟2、r2試劑的制備：
23、將褪黑素結合蛋白單克隆抗體放入離心管中，保證抗體位于離心管底部位置后加入碳酸緩沖溶液，混勻后加入化學發光標記物的dmf溶液，經過封閉、純化步驟后得到化學發光標記物標記的褪黑素結合蛋白單克隆抗體；將化學發光標記物標記的褪黑素結合蛋白單克隆抗體濃溶本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括R1試劑和R2試劑，R1試劑包括磁珠包被的褪黑素抗原，R2試劑包括化學發光標記物標記的褪黑素抗體。
2.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述磁珠包被的褪黑素抗原的磁珠上偶聯有官能團，所述官能團包括羧基、氨基和對甲苯磺酰基中的一種或多種。
3.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述磁珠包被的褪黑素抗原中，磁珠與褪黑素抗原的質量比為1-5:100。
4.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述化學發光標記物包括吖啶酯、魯米諾、異魯米諾和三聯吡啶釕中的一種或多種。
5.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述化學發光標記物與褪黑素抗體的摩爾比為5-10:1。
6.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述R1試劑還包括第一緩沖液，所述磁珠包被的褪黑素抗原保存于第一緩沖液，所述磁珠濃度為0.01-1wt％。
7.如權利要求6所述的
8.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述R2試劑還包括第二緩沖液，所述化學發光標記物標記的褪黑素抗體保存于第二緩沖液，所述化學發光標記物標記的褪黑素抗體的濃度為0.1-1μg/mL。
9.如權利要求8所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述第二緩沖液包括100-500mM?Bistris、0.05-0.1％吐溫-20和0.05-0.1％Proclin300。
10.一種人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括r1試劑和r2試劑，r1試劑包括磁珠包被的褪黑素抗原，r2試劑包括化學發光標記物標記的褪黑素抗體。
2.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述磁珠包被的褪黑素抗原的磁珠上偶聯有官能團，所述官能團包括羧基、氨基和對甲苯磺酰基中的一種或多種。
3.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述磁珠包被的褪黑素抗原中，磁珠與褪黑素抗原的質量比為1-5:100。
4.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述化學發光標記物包括吖啶酯、魯米諾、異魯米諾和三聯吡啶釕中的一種或多種。
5.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述化學發光標記物與褪黑素抗體的摩爾比為5-10:1。
6.如權利要求1所述的人褪黑素化學發光免疫檢測試劑盒，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：潘潔，李因來，
申請(專利權)人：杭州博岳生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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