【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)屬于核酸，具體涉及食管鱗癌細(xì)胞核酸適體的篩選及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、食管癌（esophageal?cancer）是世界上第九大最常見(jiàn)的消化道腫瘤。據(jù)2022年全球最新癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示2022年食管癌死亡病例數(shù)為44.51萬(wàn)，在全部癌癥數(shù)中居于第七位。我國(guó)2022年食管癌發(fā)病數(shù)為22.4萬(wàn)，死亡病例數(shù)為18.75萬(wàn)，占全球食管癌死亡病例數(shù)的42.13%，同時(shí)食管癌還呈“高發(fā)病率、高死亡率”的趨勢(shì)。食管癌按組織學(xué)特點(diǎn)可分為鱗癌、腺癌及其他類型。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal?squamous?cell?carcinoma,?escc）約占中國(guó)食管癌的90%，惡性程度程度較高，預(yù)后較差，五年生存率為10%，并且早期癥狀不明顯，被發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)病人已是中晚期，超過(guò)75%的escc在iii期或iv期被診斷出來(lái)。目前escc臨床上的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療以及新輔助治療，但是關(guān)于食管鱗癌靶向治療的報(bào)道卻很少，尚無(wú)有效靶向藥物。
2、核酸適體（aptamer）是一段對(duì)特定靶標(biāo)分子具有特異性結(jié)合能力的rna或單鏈dna，其堿基數(shù)目通常在幾十到一百個(gè)，它們通過(guò)折疊形成不同的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸適體可以結(jié)合廣泛的靶標(biāo)，包括小分子化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和組織等，核酸適體與這些靶標(biāo)分子之間的高特異性和高親和性識(shí)別結(jié)合，使之成為具有發(fā)展為這些靶標(biāo)的生物傳感器和功能調(diào)控劑的前景。核酸適體與抗體相比，具有分子量小、易合成、易修飾、成本低、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，因此在新藥研發(fā)、藥物靶向載體、生物醫(yī)學(xué)診斷（包括疾病診斷、分子成像）等醫(yī)藥
3、核酸適體的細(xì)胞篩選（cell-selex）是以整個(gè)活細(xì)胞為靶標(biāo)，通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，selex）技術(shù)篩選出一條或多條能夠特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面標(biāo)志物的單鏈dna。細(xì)胞篩選無(wú)需了解靶標(biāo)的相關(guān)信息，可以對(duì)存在于細(xì)胞表面的多種受體進(jìn)行篩選，因此可以獲得一組核酸適體探針，這些探針可以特異性識(shí)別癌細(xì)胞上的生物標(biāo)志物，根據(jù)分子水平差異將它們與正常細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本申請(qǐng)要解決的技術(shù)問(wèn)題是：如何獲得特異性靶向食管鱗癌細(xì)胞的核酸適體，并用于制備識(shí)別、診斷食管鱗癌或食管鱗癌細(xì)胞的試劑。為解決該技術(shù)問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┮韵录夹g(shù)方案：
2、本申請(qǐng)?zhí)峁┙M合物，所述組合物包括核酸適體escwl-7a、escwl-68a和escwl-75a中的至少兩種，
3、所述核酸適體escwl-7a為核苷酸序列是seq?id?no.1的單鏈?dna?分子；
4、所述核酸適體escwl-68a為核苷酸序列是seq?id?no.2的單鏈?dna?分子；
5、所述核酸適體escwl-75a為核苷酸序列是seq?id?no.?3的單鏈?dna?分子。
6、本申請(qǐng)還提供核酸適體，所述核酸適體包括核酸適體escwl-7a、escwl-68a或escwl-75a中的任一種，
7、所述核酸適體escwl-7a為核苷酸序列是seq?id?no.1的單鏈?dna?分子；
8、所述核酸適體escwl-68a為核苷酸序列是seq?id?no.2的單鏈?dna?分子；
9、所述核酸適體escwl-75a為核苷酸序列是seq?id?no.3的單鏈?dna?分子。
10、本申請(qǐng)還提供核酸適體衍生物，所述核酸適體衍生物為對(duì)組成所述核酸適體escwl-7a、escwl-68a和escwl-75a中各個(gè)單一核酸適體進(jìn)行如下操作后所得：對(duì)所述單一核酸適體的一端或中間連接熒光素、抗腫瘤藥物、放射性元素、生物酶、生物素和/或納米材料，得到與所述單一核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物。
11、進(jìn)一步地，所述組合物、核酸適體、核酸適體衍生物用于區(qū)分腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞。
12、進(jìn)一步地，所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于：人食管鱗癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、人結(jié)直腸癌細(xì)胞、人膀胱癌細(xì)胞、人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞。
13、進(jìn)一步地，所述人食管鱗癌細(xì)胞包括人食管鱗癌細(xì)胞kyse510、人食管鱗癌細(xì)胞kyse30、人食管鱗癌細(xì)胞kyse150。
14、進(jìn)一步地，所述人宮頸癌細(xì)胞包括人宮頸癌細(xì)胞hela。
15、進(jìn)一步地，所述人乳腺癌細(xì)胞包括人乳腺癌細(xì)胞sum159。
16、進(jìn)一步地，所述人結(jié)直腸癌細(xì)胞包括人結(jié)直腸癌細(xì)胞hct-8。
17、進(jìn)一步地，所述人膀胱癌細(xì)胞包括人膀胱癌細(xì)胞yts-1。
18、進(jìn)一步地，所述人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞包括人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞cem。
19、在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方式中，是在所述單一核酸適體上連接了異硫氰酸熒光素（fitc）。
20、本申請(qǐng)還提供應(yīng)用，所述應(yīng)用為所述的組合物、所述的核酸適體和/或所述的核酸適體衍生物在如下任一所述的應(yīng)用：
21、（b1）在制備用于鑒定或輔助鑒定腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
22、（b2）在鑒定或輔助鑒定腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用；
23、（b3）在制備用于鑒定或輔助鑒定腫瘤患者樣品的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
24、（b4）在鑒定或輔助鑒定腫瘤患者樣品中的應(yīng)用；
25、（b5）在制備用于對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行成像的產(chǎn)品中的應(yīng)用
26、（b6）在用于對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行成像中的應(yīng)用；
27、（b7）在制備用于對(duì)腫瘤患者樣品進(jìn)行成像的產(chǎn)品中的應(yīng)用
28、（b8）在對(duì)腫瘤患者樣品進(jìn)行成像中的應(yīng)用；
29、（b9）在制備用于腫瘤細(xì)胞和/或腫瘤患者分子分型或輔助分子分型的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
30、（b10）在腫瘤細(xì)胞和/或腫瘤患者分子分型或輔助分子分型中的應(yīng)用；
31、（b11）在制備用于治療腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
32、（b12）作為藥物在治療腫瘤中的應(yīng)用；
33、（b13）在腫瘤相關(guān)生理病理研究中的應(yīng)用；
34、（b14）在制備腫瘤相關(guān)生理病理研究的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
35、進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品包括但不限于：檢測(cè)試劑、成像試劑、藥物、研究模型。
36、具體地，本申請(qǐng)中，（b1）和（b3）中所述的產(chǎn)品可為生物傳感器。（b1）至（b4）應(yīng)用的作用原理是核酸適體與目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，其構(gòu)型會(huì)隨之發(fā)生變化。利用這一特性開(kāi)發(fā)基于核酸適體構(gòu)型變化的電化學(xué)傳感器，即e-ab（electrochemical?aptamer-based）傳感器。在醫(yī)療診斷等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。
37、具體地，本申請(qǐng)中，（b5）和（b7）中所述的產(chǎn)品可為成像試劑。（b5）至（b8）應(yīng)用的作用原理是核酸適體與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合后，通過(guò)熒光、化學(xué)發(fā)光等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和成像。
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【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.組合物，其特征在于，所述組合物包括核酸適體ESCwl-7a、ESCwl-68a和ESCwl-75a中的至少兩種，
2.核酸適體，其特征在于，所述核酸適體包括核酸適體ESCwl-7a、ESCwl-68a或ESCwl-75a中的任一種，
3.核酸適體衍生物，其特征在于，所述核酸適體衍生物為對(duì)組成權(quán)利要求1或2中所述核酸適體ESCwl-7a、ESCwl-68a和ESCwl-75a中各個(gè)單一核酸適體進(jìn)行如下操作后所得：對(duì)所述單一核酸適體的一端或中間連接熒光素、抗腫瘤藥物、放射性元素、生物酶、生物素和/或納米材料，得到與所述單一核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物。
4.應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為權(quán)利要求1所述的組合物、權(quán)利要求2所述的核酸適體和/或權(quán)利要求3所述的核酸適體衍生物在如下任一所述的應(yīng)用：
5.一種試劑，其有效成分包括權(quán)利要求1所述的組合物、權(quán)利要求2所述的核酸適體和/或權(quán)利要求3所述的核酸適體衍生物。
6.應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為權(quán)利要求5所述的試劑在如下任一所述的應(yīng)用：
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6
8.一種鑒定或輔助鑒定腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所述的組合物、權(quán)利要求2所述的核酸適體、權(quán)利要求3所述的核酸適體衍生物和/或權(quán)利要求5所述的試劑與所述腫瘤細(xì)胞接觸，以鑒定或輔助鑒定所述細(xì)胞是否為腫瘤細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于人食管鱗癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、人結(jié)直腸癌細(xì)胞、人膀胱癌細(xì)胞、人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于：人食管鱗癌細(xì)胞KYSE30、人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150。
...【技術(shù)特征摘要】
1.組合物，其特征在于，所述組合物包括核酸適體escwl-7a、escwl-68a和escwl-75a中的至少兩種，
2.核酸適體，其特征在于，所述核酸適體包括核酸適體escwl-7a、escwl-68a或escwl-75a中的任一種，
3.核酸適體衍生物，其特征在于，所述核酸適體衍生物為對(duì)組成權(quán)利要求1或2中所述核酸適體escwl-7a、escwl-68a和escwl-75a中各個(gè)單一核酸適體進(jìn)行如下操作后所得：對(duì)所述單一核酸適體的一端或中間連接熒光素、抗腫瘤藥物、放射性元素、生物酶、生物素和/或納米材料，得到與所述單一核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物。
4.應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為權(quán)利要求1所述的組合物、權(quán)利要求2所述的核酸適體和/或權(quán)利要求3所述的核酸適體衍生物在如下任一所述的應(yīng)用：
5.一種試劑，其有效成分包括權(quán)利要求1所述的組合物、權(quán)利要求2所述的核酸適體和/或權(quán)利要求3所...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王玲，邴濤，王芳，於晶晶，蔣迪，岑佳盈，尹文娟，蘇丹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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