【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物組織介電特性分析，尤其涉及一種斑馬魚心臟電生理檢測方法及其在斑馬魚心臟鈣信號檢測中應用。
技術介紹
1、電生理指標常用于臨床醫療診斷，比如研究人員通過在發育早期斑馬魚上進行體鈣成像和電生理記錄，發現穆勒膠質細胞通過不同的受體和轉運體參與和調節視網膜自發活動波(膠質細胞參與調節視網膜自發活動波----中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(四類機構))。此外，還有研究通過透明皮膚在全腦尺度上對神經元活動進行在體電生理或光學成像記錄(技術干貨|斑馬魚視覺神經信號研究進展及方法深度解析)。目前應用于斑馬魚上的電生理檢測技術還是基于在體或離體的成年斑馬魚心臟，利用斑馬魚早期胚胎離體心臟做鈣成像等的電生理檢測技術鮮有報道，且這種方法能否解決體內實驗的上述缺陷，本領域也未知曉。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種斑馬魚心臟電生理檢測方法及其應用。本專利技術主要通過使用一種尤其適宜斑馬魚心臟活力保持的臺氏液、一種專用于斑馬魚離體心臟的染液進行。所述臺氏液為等滲離子溶液，其中溶有的各種離子可保證斑馬魚心臟的離子交換，進而可保持其不會因為過滲或者失水情況等失活。基于所述臺氏液制成的染液可讓斑馬魚心臟在長時間染色過程中也能保證心臟活力。所述染液為低、高濃度鈣敏感染液組合，使用順序為先高濃度，再低濃度。本專利技術能滿足電生理相關文獻中所需各種數據之要求，尤其可體現細胞內的鈣信號變化情況，且由于幼年斑馬魚心臟體積小，所需鈣敏感染料也十分少，同時也無須待其成年才可開
2、為了實現上述目的，本專利技術采用了如下的技術方案：
3、本專利技術目的之一是提供一種可保持斑馬魚離體心臟活性的臺氏液，所述臺氏液由130～150mm?nacl、4～6mm?kcl、0.5～1.5mm?mgcl2·6h2o、5～10mm?hepes、5～10mm?d-glucose、1.5～2.0mm?cacl2·2h2o以及0～0.5mmna2hpo4·2h2o組成。
4、優選的，所述臺氏液由136mmnacl、5.4mmkcl、1mmmgcl2·6h2o、10mm?hepes(sangon?biotech，cas:[75277-39-3])、5mm?d-glucose(sangon?biotech，cas#[50-99-7])、1.8mm?cacl2·2h2o以及0.3mm?na2hpo4·2h2o組成。
5、本專利技術目的之二是提供一種基于所述臺氏液的斑馬魚離體心臟染液，其為一種低濃度鈣敏感染液和高濃度鈣敏感染液組合。
6、進一步的，每體系所述低濃度鈣敏感染液中包括6～8μm?rhod2和9～11μmblebbistatin，每體系所述高濃度鈣敏感染液中包括13～14μm?rhod2和9～11μmblebbistatin，剩余由所述臺氏液補齊；且所述所述低濃度鈣敏感染液和所述高濃度鈣敏感染液使用時每1毫升體系中需另加1～3μl?f127。
7、優選的，所述低濃度鈣敏感染液：1體系＝rhod2(7μm)+blebbistatin(10μm)+臺氏液補齊；所述高濃度鈣敏感染液：1體系＝rhod2(14μm)+blebbistatin(10μm)+臺氏液補齊；且當所述低濃度鈣敏感染液和所述高濃度鈣敏感染液具體使用時，每1ml體系中都需另加2μl?f127。
8、本專利技術目的之三是提供一種基于所述臺氏液的斑馬魚離體心臟停跳液，每體系所述斑馬魚離體心臟停跳液中包括9～11μm?blebbistatin，剩余由所述臺氏液補齊。
9、優選的，所述停跳液：1體系＝blebbistatin(10μm)+臺氏液補齊。
10、所述斑馬魚離體心臟染液和所述斑馬魚離體心臟停跳液具體制備之前還包括試劑準備的步驟：先用dmso配制rhod2(abcam?ab142780)(鈣敏感染料)和blebbistatin(macklin?b873251-5mg)(心臟停跳劑)母液，f127(invitrogen?p3000mp)(打孔)直接可用。
11、本專利技術目的之四是提供一種斑馬魚體心臟電生理檢測方法，其中包括使用所述斑馬魚離體心臟染液和/或所述斑馬魚離體心臟停跳液。
12、進一步的，所述斑馬魚心臟電生理檢測方法包括以下步驟：
13、(1)選用幼年斑馬魚，低溫休克分離出完整心臟；
14、(2)使用所述高濃度鈣敏感染液浸沒心臟染色；
15、(3)去除所述高濃度鈣敏感染液，使用所述低濃度鈣敏感染液浸沒心臟染色；
16、(4)去除所述低濃度鈣敏感染液，用所述停跳液浸沒心臟；
17、(5)上機記錄。
18、更進一步的，所述步驟(1)中最早可選用3dpf斑馬魚，且心臟分離使用針灸針，針灸針的處理方式為：將其用膠帶加固針體，露出一點針尖。具體分離步驟如下：
19、1.切斷心臟的流入道和流出道分離出心包腔；
20、2.分離心包腔殘余組織碎片得到完整心臟。
21、再進一步的，所述步驟(2)中的染色方法為在搖床上緩慢搖動1～3min。
22、優選的，所述染色方法為在搖床上緩慢搖動2min。
23、又進一步的，所述步驟(3)中的染色方法為在搖床上緩慢搖動8～12min。
24、優選的，所述染色方法為在搖床上緩慢搖動10min。
25、本專利技術目的之五是提供一種所述臺氏液、所述斑馬魚離體心臟染液、所述斑馬魚離體心臟停跳液和/或所述斑馬魚心臟電生理檢測方法在斑馬魚心臟鈣信號檢測中的應用。
26、本專利技術的關鍵在于：
27、一、體外細胞電生理實驗主要針對單個細胞或細胞群進行電生理記錄，如神經元、心肌細胞等，而一般大型離體心臟電生理實驗是利用完整的心臟組織進行電生理研究，通常采用langendorff灌流系統，通過冠狀動脈灌注營養液來維持心臟的生理狀態。然而像斑馬魚這種小心臟，卻無法進行灌流來保持心臟活力，而是通過浸泡在臺氏液中保持活力，這種方法操作更為簡便化，且也能實時監測心臟收縮舒張等各項指標，同時還能觀察不同藥物引起的心臟變化，可控制性強。所以本專利技術采用臺氏液浸泡的方式。
28、二、離體心臟易失活，所以分離心臟需在配制好的臺氏液中完成。同時不同動物細胞可承受的滲透壓不一樣，所以臺氏液的離子濃度存在差異。本專利技術研發了一種尤其適合斑馬魚心臟保持活力的臺氏液。該臺氏液為等滲離子溶液，其中溶有各種離子，可保證斑馬魚心臟的離子交換，進而可保持斑馬魚心臟不會因為過滲或者失水情況等失活，可在一段時間內保持斑馬魚心臟活力；其中含有的葡萄糖能夠為斑馬魚心臟提供營養等。同時本專利技術中的染液溶劑為所述臺氏液與染料的混合溶液，這種混合溶液可讓斑馬魚心臟在長時間染色過程中也能保證心臟活力。
29、三、一般情況下，電生理技術運用于在體心臟上時可進行的操作是電極刺激本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種可保持斑馬魚離體心臟活性的臺氏液，其特征在于，所述臺氏液由130～150mMNaCl、4～6mM?KCl、0.5～1.5mM?MgCl2·6H2O、5～10mM?HEPES、5～10mM?D-glucose、1.5～2.0mM?CaCl2·2H2O以及0～0.5mM?Na2HPO4·2H2O組成。
2.一種基于權利要求1中所述臺氏液的斑馬魚離體心臟染液，其特征在于，其為一種低濃度鈣敏感染液和高濃度鈣敏感染液組合。
3.根據權利要求2所述的斑馬魚離體心臟染液，其特征在于，每體系所述低濃度鈣敏感染液中包括6～8μM?Rhod2和9～11μM?Blebbistatin，每體系所述高濃度鈣敏感染液中包括13～14μM?Rhod2和9～11μM?Blebbistatin，剩余由權利要求1中所述的臺氏液補齊；且所述所述低濃度鈣敏感染液和所述高濃度鈣敏感染液使用時每1ml體系中需另加1～3μl?F127。
4.一種基于權利要求1中所述臺氏液的斑馬魚離體心臟停跳液，其特征在于，每體系所述斑馬魚離體心臟停跳液中包括9～11μM?Blebbistatin，
5.一種斑馬魚心臟電生理檢測方法，其特征在于，其中包括使用權利要求2～3中任一所述的斑馬魚離體心臟染液和/或權利要求4中所述的斑馬魚離體心臟停跳液。
6.根據權利要求5所述的斑馬魚心臟電生理檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
7.根據權利要求6所述的斑馬魚心臟電生理檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中最早可選用3dpf斑馬魚，且心臟分離使用針灸針，針灸針的處理方式為：將其用膠帶加固針體，露出一點針尖。
8.根據權利要求7所述的斑馬魚心臟電生理檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中的染色方法為在搖床上緩慢搖動1～3min，所述步驟(3)中的染色方法為在搖床上緩慢搖動8～12min。
9.一種斑馬魚心臟分離方法，其特征在于，所述方法即為權利要求6～8任一所述斑馬魚心臟電生理檢測方法中所使用的斑馬魚心臟分離方法。
10.權利要求1中所述的臺氏液、權利要求2～3中任一所述的斑馬魚離體心臟染液、權利要求4中所述的斑馬魚離體心臟停跳液、權利要求5～8中任一所述的斑馬魚心臟電生理檢測方法和/或權利要求9所述的斑馬魚心臟分離方法在斑馬魚心臟相關實驗研究、疾病研究和/或后續產品轉化中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種可保持斑馬魚離體心臟活性的臺氏液，其特征在于，所述臺氏液由130～150mmnacl、4～6mm?kcl、0.5～1.5mm?mgcl2·6h2o、5～10mm?hepes、5～10mm?d-glucose、1.5～2.0mm?cacl2·2h2o以及0～0.5mm?na2hpo4·2h2o組成。
2.一種基于權利要求1中所述臺氏液的斑馬魚離體心臟染液，其特征在于，其為一種低濃度鈣敏感染液和高濃度鈣敏感染液組合。
3.根據權利要求2所述的斑馬魚離體心臟染液，其特征在于，每體系所述低濃度鈣敏感染液中包括6～8μm?rhod2和9～11μm?blebbistatin，每體系所述高濃度鈣敏感染液中包括13～14μm?rhod2和9～11μm?blebbistatin，剩余由權利要求1中所述的臺氏液補齊；且所述所述低濃度鈣敏感染液和所述高濃度鈣敏感染液使用時每1ml體系中需另加1～3μl?f127。
4.一種基于權利要求1中所述臺氏液的斑馬魚離體心臟停跳液，其特征在于，每體系所述斑馬魚離體心臟停跳液中包括9～11μm?blebbistatin，剩余由權利要求1中所述的臺氏液補齊。
5.一種...
【專利技術屬性】
技術研發人員：祖堯，高文杰，
申請(專利權)人：上海水大技術轉移有限公司，
類型：發明
國別省市：
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