【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞領(lǐng)域，尤其涉及一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法。
技術(shù)介紹
1、肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)的最新統(tǒng)計，hcc在全球發(fā)病率中位居第六位，是全球腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因。雖然hcc存在明確的危險因素，但是大多數(shù)患者在診斷時已是晚期，且肝細(xì)胞癌患者預(yù)后較差，3年生存率僅為12.7％。因此，探究hcc潛在的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制，并尋找有效的分子靶點對提供新的治療方向具有重要的臨床意義。
2、三羧酸循環(huán)(tricarboxylicacidcycle，tcacycle)是細(xì)胞新陳代謝和能量產(chǎn)生的中心樞紐，對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。現(xiàn)已證實tca循環(huán)酶的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核中也存在tca循環(huán)相關(guān)酶，包括檸檬酸合酶(citratesynthase,cs)，烏頭酸酶2(aconitase2,aco2)和異檸檬酸脫氫酶3(isocitratedehydrogenase3，idh3)等，并證實了這些核酶催化的生化反應(yīng)類似于線粒體中這些酶相對應(yīng)催化的生化反應(yīng)，并構(gòu)成了細(xì)胞核中不完整的tca循環(huán)(nucleartcacycle,ntcacycle)。
3、aco2是tca循環(huán)中的一個關(guān)鍵酶，它能夠催化檸檬酸鹽和異檸檬酸鹽之間的相互轉(zhuǎn)化，它也是連接tca循環(huán)和脂質(zhì)代謝的必需酶。研究發(fā)現(xiàn)，aco2在多種腫瘤類型中高表達(dá)，且aco2可以作為腫瘤診斷和預(yù)測的生物標(biāo)志物。現(xiàn)已證實aco2在肝
4、然而，對于aco2在肝癌細(xì)胞中發(fā)生核轉(zhuǎn)移的作用機制及其對hcc的影響也尤為重要。
5、為此，本專利技術(shù)提出一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，而提出的一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用了如下技術(shù)方案：
3、一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，包括以下步驟：
4、s1：細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，將細(xì)胞放置于dmem的完全培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，然后進行傳代；
5、s2：質(zhì)粒構(gòu)建，選擇質(zhì)粒并構(gòu)建；
6、s3：細(xì)胞轉(zhuǎn)染，取培養(yǎng)和傳代后的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染；
7、s4：edu實驗檢測質(zhì)粒進入細(xì)胞情況；
8、s5：免疫熒光染色檢測相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)；
9、s6：劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移；
10、s7：transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲；
11、s8：統(tǒng)計結(jié)果。
12、優(yōu)選地：所述s1步驟中，其包括以下步驟：
13、s11：選擇肝癌細(xì)胞系plc5細(xì)胞，將其培養(yǎng)于包含10％胎牛血清、1％青鏈霉的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5％二氧化碳濃度、37攝氏度；
14、s12：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50％后，隨即將細(xì)胞置于維持在含94％氮氣、5％二氧化碳、1％氧氣低氧條件下的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
15、s13：直至細(xì)胞密度達(dá)到70％后進行傳代處理。
16、優(yōu)選地：所述s2步驟中，質(zhì)粒為野生型aco2質(zhì)粒：pcmv-aco2(human)-3×flag-neo，同時構(gòu)建核定位序列缺失的aco2質(zhì)粒，nls的上游引物序列為5’-cagtgggacagggagaagaacac-3’；下游引物序列為3’-gtgttcttctccctgtcccactg-5’。
17、優(yōu)選地：所述s3步驟中，其包括以下步驟：
18、s31：取對數(shù)生長期的plc5肝癌細(xì)胞，鏡下計數(shù)；
19、s32：在24孔板中每孔500μl培養(yǎng)基接種1.5×104個細(xì)胞；
20、s33：在孵箱將細(xì)胞培養(yǎng)24h后，按照lipo8000tm轉(zhuǎn)染試劑的要求，將野生型aco2質(zhì)粒和核定位序列缺失的aco2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入plc5細(xì)胞中；
21、s34：轉(zhuǎn)染12h后更換新鮮培養(yǎng)基，48h后進行檢測。
22、優(yōu)選地：所述s4步驟中，其包括以下步驟：
23、s41：取對數(shù)生長期的plc5細(xì)胞，鏡下計數(shù)，在24孔板中每孔500μl培養(yǎng)基接種1.5×104個細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，隨即進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；
24、s42：將轉(zhuǎn)染aco2wt質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染aco2δnls質(zhì)粒的這兩組細(xì)胞在含5％co2，37℃的培養(yǎng)箱中和含94％n2，5％co2，1％o2低氧條件下的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48h；
25、s43：對細(xì)胞進行染色處理，在倒置熒光顯微鏡下對結(jié)果進行觀察并拍照記錄，重復(fù)三次。
26、優(yōu)選地：所述s5步驟中，其包括以下步驟：
27、s51：首先檢測低氧對aco2入核的影響；
28、s52：接著檢測入核序列缺失對aco2入核的影響。
29、優(yōu)選地：所述s6步驟，其包括以下步驟：
30、s61：將細(xì)胞體系分為四組，分別為aco2wt+control組，aco2wt+1％o2組，aco2δnls+control組，aco2δnls+1％o2組；
31、s62：取對數(shù)生長期的plc5細(xì)胞，以每孔2ml培養(yǎng)基5×104個細(xì)胞的密度均勻接種于6孔板中；
32、s63：待細(xì)胞密度長至50％，將aco2wt質(zhì)粒和aco2δnls質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中；
33、s64：aco2wt+control組和aco2δnls+control組置于5％co2，37℃的孵箱中，aco2wt+1％o2組和aco2δnls+1％o2組置于9％n2，5％co2，1％o2的孵箱中；
34、s65：待細(xì)胞長滿后，用滅菌的200μl槍頭在細(xì)胞單層的央中區(qū)域劃出筆直的劃痕，用pbs清洗掉劃下的細(xì)胞，加入dmem完全培養(yǎng)基，隨即在顯微鏡下進行觀察、拍照；
35、s66：將aco2wt+control組和aco2δnls+control組置于5％co2，37℃的孵箱中，aco2wt+1％o2組和aco2δnls+1％o2組置于低氧條件下的孵箱中，培養(yǎng)24h后，在顯微鏡下進行觀察，每組隨機選取3個視野拍照后于imagej軟件分析。
36、優(yōu)選地：所述s7步驟，其包括以下步驟：
37、s71：將細(xì)胞分為四組，分別為aco2wt+control組，aco2wt+1％o2組，aco2δnls+control組，aco2δnls+1％o2組；
38、s72：待培養(yǎng)皿中細(xì)胞密度長至50％時，將aco2wt質(zhì)粒和aco2δnls質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中；
39、s73：將aco2wt+control組和a本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述S1步驟中，其包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述S2步驟中，質(zhì)粒為野生型ACO2質(zhì)粒：pCMV-ACO2(human)-3×FLAG-Neo，同時構(gòu)建核定位序列缺失的ACO2質(zhì)粒，NLS的上游引物序列為5’-CAGTGGGACAGGGAGAAGAACAC-3’；下游引物序列為3’-GTGTTCTTCTCCCTGTCCCACTG-5’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述S3步驟中，其包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述S4步驟中，其包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述S6步驟，其包括以下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述S7步驟，其包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)ACO2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述S8步驟中，采用GraphPadPrism9統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述s1步驟中，其包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述s2步驟中，質(zhì)粒為野生型aco2質(zhì)粒：pcmv-aco2(human)-3×flag-neo，同時構(gòu)建核定位序列缺失的aco2質(zhì)粒，nls的上游引物序列為5’-cagtgggacagggagaagaacac-3’；下游引物序列為3’-gtgttcttctccctgtcccactg-5’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低氧誘導(dǎo)aco2入核促進肝癌細(xì)胞增殖和遷移的方法，其特征在于，所述s3步驟中，其包括以...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李蕓瑩，李靜，陳地龍，
申請(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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