【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細菌檢測，更具體的說是涉及一種快速廣譜檢測沙門氏菌的方法。
技術介紹
1、沙門氏菌屬于腸桿菌科，包括腸道沙門氏菌(s.enterica)和邦戈爾沙門氏菌(s.bongori)，是一大類無芽孢、無莢膜的革蘭氏陰性兼性厭氧細菌。沙門氏菌是引起全球細菌性食源性疾病的主要致病菌，也是各國和國際組織普遍管控的致病菌。它廣泛分布于自然界，常常寄居在人和動物體內，特別是家禽、家畜及寵物的腸道中。沙門氏菌常常與全球范圍內的食物中毒事件相關，主要污染的食品有：乳制品、肉制品、蛋制品等。沙門氏菌不分解蛋白質，食物被其感染后在外觀和味道上難以察覺，且沙門氏菌的感染劑量相對較低。沙門氏菌對人體健康具有嚴重的危害，攝入的病原菌在胃的酸性環境存活后，會進入小腸，跨越小腸的黏液層黏附于腸上皮細胞，誘發一系列腸道炎癥，甚至全身系統性感染，表現為嘔吐、腹瀉、腹痛，重者可引發脫水、休克，部分病人可發展為敗血癥，多見于兒童和免疫力低下的人群，對于免疫功能低下的人群，沙門氏菌的感染甚至可能威脅生命。
2、傳統的檢測方法如標準平板計數法、聚合酶鏈反應(pcr)和酶聯免疫吸附法(elisa)，雖然具有高精度和高特異性，但相應的存在一些缺點。平板計數法檢測時間長，通常需要數天的培養才可得到檢測結果，耗時耗力，不適用于多樣本檢測和現場的快速檢測；pcr雖然靈敏度高，但常常產生假陰性或假陽性的鑒定結果，同時，pcr只能檢測dna或rna的存在，無法直接反映微生物的活性；elisa盡管廣泛應用于抗原檢測，但其對實驗條件(如溫度和ph等)要求較高，導致靈敏
3、因此，提供一種開發快速、高選擇性和超靈敏的新技術，及時準確地檢測沙門氏菌病原體，預防食源性疾病是本領域技術人員亟需解決的問題。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術提供了一種基于sers適配體生物傳感器快速廣譜檢測沙門氏菌的方法。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、一種快速廣譜檢測沙門氏菌的方法，包括以下步驟：
4、(1)標記sers(表面增強拉曼散射)探針的制備
5、1)17mg?agno3溶于100ml超純水中，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，快速注入2ml?1％檸檬酸三鈉，煮沸40min，自然冷卻至室溫，得ag?nps(納米顆粒)溶液；含銀納米粒子的最終溶液呈黃綠色；
6、2)取10ml步驟1)制備的ag?nps溶液加入200μl?0.1mm?4mba(4-巰基苯甲酸)溶液，劇烈攪拌5h后，將混合物離心，并將沉淀重分散于2ml超純水中，得ag@mba?nps溶液，4℃保存備用；
7、3)將222μl?2％haucl4溶液、240μl?0.2mnaoh溶液、3ml?0.01mna2so3溶液加入4.538ml超純水中，得au生長溶液，在4℃條件下靜置保存備用；
8、4)將2ml步驟2)制備的ag@4mba?nps溶液、2.55ml超純水、1ml5％pvp(聚乙烯吡咯烷酮)溶液、200μl?0.5m?aa(抗壞血酸)溶液、200μl0.5m?naoh溶液、50μl?0.1m?na2so3溶液、4ml步驟3)制備的au生長液加入25ml玻璃小瓶中，磁力攪拌30min后，將溶液離心，并將沉淀重分散于2ml超純水中，得ag@4mba@aunps溶液備用；
9、表面增強拉曼散射(surface-enhanced?raman?spectroscopy，sers)是拉曼光譜和納米技術的結合。近年來，表面增強拉曼散射(sers)因其具有顯著的靈敏度和特異性、指紋識別能力強、無損分析、光譜采集速度快等優點被認為是一種很有前途的細菌快速檢測方法，它已廣泛應用于食品安全、醫藥研究和環境控制等領域。貴金屬納米顆粒在sers襯底的制備中具有重要意義，它對sers傳感器拉曼信號的穩定性、可重復性和增強有重要影響。納米顆粒間的小距離間隙或尖銳的向外分支尖端稱為”熱點”，它們有助于增強sers活性底物(如納米顆粒、納米星、四面體和衛星結構等)的拉曼信號。此外，貴金屬納米顆粒在拉曼染料分子或生物識別分子(如抗體、適配體、凝集素、抗生素等)功能化后，產生特征sers信號并可特異性結合目標細菌。
10、(2)fe3o4@au@ag磁性復合材料的制備
11、5)將1.35g?fecl3·6h2o和1g?peg(聚乙二醇)加入40ml乙二醇中攪拌至澄清溶液，緩慢加入3.6g?naac，強力攪拌30min，將混合溶液轉移到鐵氟龍內襯的不銹鋼高壓滅菌器中，200℃下反應10h，冷卻至室溫，交替使用超純水和無水乙醇進行磁分離洗滌，重復3次，將洗滌產物放入真空干燥箱中60℃干燥10h待用，得fe3o4?mnps(磁性納米顆粒)；
12、6)將100ml?0.01％haucl4溶液在油浴鍋條件下加熱至煮沸，在劇烈攪拌條件下快速加入1ml?1.0％檸檬酸三鈉溶液，溶液先由淺黃色變為灰黑色，最后變為酒紅色并保持不變，此時將溶液保持沸騰15min后在室溫下冷卻，得aunps溶液，4℃保存備用；將1.5ml?0.1maa溶液和0.5ml?1mm?agno3溶液混合到10ml?au?nps溶液中，劇烈攪拌30min后，酒紅色變為橙黃色，將攪拌后的溶液離心，并將沉淀重分散在10ml超純水中，得au@agnps溶液備用。
13、7)取40mg步驟5)制備的fe3o4?mnps加入到40ml?10mg/ml?pei溶液中超聲混合2小時，得到fe3o4@pei溶液，用超純水磁分離洗滌3次，以去除多余的pei，得fe3o4@pei；將10mgfe3o4@pei加入到100ml步驟6)制備的au@ag?nps溶液中，超聲30min，將產物用磁鐵分離，去離子水洗滌四次，重分散于4ml超純水中，得fe3o4@au@ag?mnps溶液備用；
14、磁性納米顆粒因其獨特的特性而受到廣泛關注，例如小尺寸效應、表面效應、特殊的磁性和良好的生物相容性等。磁性納米顆粒殼層構型是更穩固的結構，而且殼層為表面修飾和功能化提供了平臺。磁性復合納米材料(fe3o4@au@ag)的合成尤其引人關注，因為金銀核殼結構不僅能提供抗體或適配體等的結合位點，還能進行表面衍生化通過空間或電子排斥作用幫助減少顆粒聚集，改善生物相容性。
15、(3)fe3o4@au@ag?nps與ag@4mba@aunps結合構建適配體傳感器
16、8)取1ml步驟4)制備的ag@4mba@au?nps溶液加入20μl?10μmsh-apt溶液，在室溫下下孵育12h，離心去除過量的sh-apt，將產物用pbs緩沖液洗滌本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種快速廣譜檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述離心條件為8000rpm，10min。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBS緩沖液的濃度為10mM，PH為7.4。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟8)所述SH-Apt的序列為：
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟8)所述SH-cDNA的序列為：
【技術特征摘要】
1.一種快速廣譜檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述離心條件為8000rpm，10min。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述pb...
【專利技術屬性】
技術研發人員：梁培，鄭麗，王玉峰，陳強，黃杰，舒海波，
申請(專利權)人：中國計量大學，
類型：發明
國別省市：
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