【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因敲除，尤其涉及pomgnt1基因敲除小鼠模型及構建方法、應用。
技術介紹
1、蛋白質翻譯后修飾（post-translational?modifications,?ptms）是一種化學修飾，它促進了從基因組水平到蛋白質組復雜性的增加。高等真核生物的蛋白質翻譯后修飾主要包括甲基化、泛素化、乙酰化、糖基化、磷酸化等，其中糖基化是最常見的ptms之一，它能夠增加蛋白質的異質性和功能多樣性，參與信號傳導、轉錄和細胞骨架的穩定，與神經變性疾病的發生相關。近年來，發現蛋白質的糖基化在中樞神經系統發育中起到重要作用,如o-glcnac糖基化修飾能調節神經元的功能；n-糖基化修飾可以調控神經干細胞分化和腦發育；甘露糖基化修飾不足會導致先天性肌營養不良癥，嚴重的肌肉萎縮大腦發育異常。
2、甘露糖基化修飾是哺乳動物中必不可少的糖基化修飾，o-甘露糖占大腦中已知的o-連接多糖的30%。在體內，甘露糖基化形成需要甘露糖基轉移酶的參與，n-乙酰氨基葡萄糖-氧位-甘露糖轉移酶1(protein-o-linked?mannose?b1,2?-n-acetylglucosaminyl-transferasel,pomgnt1)是研究較為深入的一種甘露糖基轉移酶。利用逆轉錄酶鏈式反應方法分析pomgnt1的mrna在人的腦灰質、白質、小腦、脊髓、膈肌、心臟、胰腺、肝臟和腎臟等不同組織中的表達，結果發現pomgnt1的轉錄產物在中樞神經系統和骨骼肌在內的各種組織中都有表達。在正常小鼠腦組織中，pomgnt1的轉錄產物和蛋白產物在大腦皮
3、pomgnt1具有經典的甘露糖基轉移酶特點，它能催化n-乙酰-葡萄糖胺基團(gicnac)?轉移到糖蛋白氧位連接的甘露糖上，該酶的缺陷會導致甘露糖基化不足，成年后認知功能障礙就是一個突出的表現。pomgnt1的突變會對腦組織中的某些蛋白的翻譯后修飾產生影響，如抗肌營養不良相關糖蛋白(dystroglycan，dg)，pomgnt1能增加dg位于細胞外的α亞單位甘露糖基，從而促進dg與細胞外基質的基膜（basement?membrane，bm）相互連接，甘露糖基化修飾不足的α-dg與細胞外基質的層粘連蛋白、膠原蛋白結合力減弱。pomgnt1基因突變導致肌-眼-腦（muscle-eye-brain,?meb）病，其主要特征之一是大腦的解剖異常，這些發現說明pomgnt1在體內可能通過對α-dg的甘露糖基化修飾，從而影響大腦的發育。在高等動物的組織/器官中，大腦作為功能最為復雜的部分，其蛋白表達的調控也最為復雜精細。pomgnt1蛋白的這種特異性表達特征以及對甘露糖基化修飾的影響，提示pomgnt1蛋白在大腦的發育中具有重要作用。
4、結合pomgnt1在腦內的特異性表達特征以及對腦的結構和功能的影響，本方案構建了腦特異性pomgnt1基因敲除小鼠（前額葉和海馬敲除），進一步探索在小鼠的腦發育過程中，pomgnt1對腦的結構和功能的影響。
技術實現思路
1、為解決現有技術不足，本專利技術提供pomgnt1基因敲除小鼠模型及構建方法、應用，能構建pomgnt1基因敲除小鼠模型，以便用于對腦結構和功能深入研究。
2、為了實現本專利技術的目的，擬采用以下方案：
3、一種pomgnt1基因敲除小鼠模型構建方法，包括以下步驟：
4、s1、通過crispr/cas9技術，將cas9?mrna、grna和打靶載體電轉到小鼠受精卵中，移植受精卵到代孕鼠體內并產出f0代，篩選得到條件性敲除pomgnt1基因的floxp小鼠；
5、s2、獲得camk2α-cre工具鼠；
6、s3、將雜合子floxp小鼠與camk2α-cre工具鼠雜交，獲得camk2α-cre/pomgnt1f/+基因鼠；camk2α-cre/pomgnt1f/+基因鼠和純合子floxp小鼠雜交或者雌雄camk2α-cre/pomgnt1f/+基因鼠交配，篩選得到特異性敲除pomgnt1基因的小鼠模型。
7、進一步的，步驟s1中，條件性敲除pomgnt1基因的floxp小鼠的篩選鑒定引物包括：
8、pomgnt1-floxp-f:5’-acttcctaatccctttggcttca-3’；
9、pomgnt1-floxp-r:5’-ccatccaccttttaacacttccct-3’。
10、一種pomgnt1基因敲除小鼠模型，由所述的構建方法得到。
11、所述的pomgnt1基因敲除小鼠模型在精神神經疾病領域的用途，所述的pomgnt1基因敲除小鼠模型用于退化神經元的檢測。
12、所述的pomgnt1基因敲除小鼠模型在精神神經疾病領域的用途，所述的pomgnt1基因敲除小鼠模型用于前額葉和海馬的細胞壞死檢測。
13、本專利技術的有益效果在于：能夠構建一種特異性pomgnt1基因敲除小鼠，以便進一步探索pomgnt1對腦的結構和功能的影響；pomgnt1基因敲除小鼠能夠用于退化神經元的檢測，結果發現小鼠海馬和前額葉退化神經元增多，說明小鼠的腦內神經元早衰；pomgnt1基因敲除小鼠能夠用于前額葉和海馬的細胞壞死檢測，結果發現小鼠的ca3區出現明顯的病理改變，該區與海馬的錐體細胞出現壞死。
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1.一種POMGnT1基因敲除小鼠模型構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的POMGnT1基因敲除小鼠模型構建方法，其特征在于，步驟S1中，條件性敲除POMGnT1基因的floxp小鼠的篩選鑒定引物包括：
3.一種POMGnT1基因敲除小鼠模型，其特征在于，由權利要求1或2所述的構建方法得到。
4.權利要求3所述的POMGnT1基因敲除小鼠模型在精神神經疾病領域的用途，其特征在于，所述的POMGnT1基因敲除小鼠模型用于退化神經元的檢測。
5.權利要求3所述的POMGnT1基因敲除小鼠模型在精神神經疾病領域的用途，其特征在于，所述的POMGnT1基因敲除小鼠模型用于前額葉和海馬的細胞壞死檢測。
【技術特征摘要】
1.一種pomgnt1基因敲除小鼠模型構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的pomgnt1基因敲除小鼠模型構建方法，其特征在于，步驟s1中，條件性敲除pomgnt1基因的floxp小鼠的篩選鑒定引物包括：
3.一種pomgnt1基因敲除小鼠模型，其特征在于，由權利要求1或2所述的構建方法...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李小鳳，郝夏，王松勝，賀桂瓊，
申請(專利權)人：重慶醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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