【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物化學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及的是一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法。
技術(shù)介紹
1、糖類是維持生命活動(dòng)所需能量的主要來源，在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，包括單糖(葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖等)、低聚糖(麥芽糖、蔗糖、乳糖等二糖和3-10個(gè)單糖形成的聚合物)、多聚糖(10個(gè)以上單糖形成的聚合物)及衍生物(糖醇、環(huán)糊精等)。單糖和二糖是一類在營(yíng)養(yǎng)水平甚至在細(xì)胞水平上具有重要價(jià)值的糖類化合物，而具有益生元特性的低聚糖和具有公認(rèn)健康特性的多糖類食品也受到研究人員和食品行業(yè)的極大關(guān)注。鑒于糖類化合物廣泛的來源、用途和多樣的生物活性，精準(zhǔn)評(píng)估食品中糖類化合物的賦存種類與含量組成特征，對(duì)于深入理解和評(píng)估糖類化合物結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、以及健康影響具有重要意義。
2、目前糖含量的測(cè)定方法主要有化學(xué)法和儀器分析法。化學(xué)法可以測(cè)定糖的總量，但無法區(qū)分糖的種類。儀器分析法中高效液相色譜法一般采用示差折光檢測(cè)器，靈敏度較低、難以檢測(cè)三糖以上的低聚糖；高效離子色譜與脈沖安培檢測(cè)器聯(lián)用靈敏度較高，但不能提供結(jié)構(gòu)信息，不利于復(fù)雜樣品中糖類的特異性分析。與之相比，質(zhì)譜法選擇性好、能顯示糖類化合物結(jié)構(gòu)特征，被認(rèn)為是糖類分析的一種重要技術(shù)，但是目前主要存在兩個(gè)方面的問題。一是糖類、特別是三糖以上化合物的高親水性和低表面活性導(dǎo)致它們不易質(zhì)譜電離、檢測(cè)靈敏度不高。有研究報(bào)道在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(lc-ms)中液相柱后添加二氯甲烷、氯仿等能使單糖和二糖形成[m+cl]-加合物增強(qiáng)其質(zhì)譜電離，但是流動(dòng)注射泵柱后添加導(dǎo)致儀器難
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述至少一個(gè)技術(shù)問題，本專利技術(shù)的目的在于提出一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量分析糖類化合物的新方法。在流動(dòng)相中添加可同時(shí)溶解于水相和有機(jī)相的氯化季膦鹽或季銨鹽，通過在電噴霧離子源形成特異的糖類氯增強(qiáng)電離信號(hào)([m+cl]-)，極大提高分析靈敏度，質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)比已報(bào)道流動(dòng)相柱后添加氯仿或鹽酸胍的lc-ms方法提高達(dá)700倍；進(jìn)一步基于糖類氯親和產(chǎn)物的特征同位素峰分布特征，以及可電離點(diǎn)位增加的多糖化合物可獲得雙電荷離子、從而顯著增加質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)量范圍的特點(diǎn)，建立了基于糖類完整分子的有機(jī)膦鹽氯增強(qiáng)電離的液相色譜高分辨質(zhì)譜(uplc-esi-hrms)聯(lián)用分析的高靈敏高通量掃描方法，為食品、生物和環(huán)境樣本中糖類化合物的靶向檢測(cè)及非靶向篩查提供了新技術(shù)。
2、為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，包括如下步驟：
4、提取待測(cè)樣品中的糖類化合物，得到提取液；
5、選擇流動(dòng)相添加劑、色譜柱，優(yōu)化流動(dòng)相梯度和上樣溶液組成，將糖類化合物提取液進(jìn)行uplc-esi-hrms掃描；
6、利用uplc-esi-hrms掃描結(jié)果，靶向檢測(cè)有標(biāo)準(zhǔn)品的糖類化合物及非靶向鑒定未知的糖類。
7、作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，所述提取樣品包括但不限于食品樣品、生物樣品或環(huán)境樣品。
8、作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，所述提取待測(cè)樣品中糖類化合物的具體方法為：
9、在待測(cè)樣品中加入5μg葡萄糖-13c6內(nèi)標(biāo)物，先加入200-2000μl冰凍甲醇、渦旋混勻后在4℃下以10000rpm離心5min至完全相分離獲得上清液；接著加200-2000μl冰水、渦旋混勻后在4℃下以10000rpm離心5min至完全相分離獲得上清液；再加200-2000μl冰凍乙腈、渦旋混勻后在4℃下以10000rpm離心5min至完全相分離獲得上清液；收集所有上清液即為糖類化合物提取液。
10、作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，根據(jù)樣品性質(zhì)及目標(biāo)分析物濃度水平?jīng)Q定提取液稀釋倍數(shù)，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)樣uplc-esi-hrms分析。
11、優(yōu)選的，作為一個(gè)較佳的實(shí)施方式，所述待測(cè)樣品為液體樣品時(shí)，待測(cè)樣品的用量為10-2000μl；所述待測(cè)樣品為固體樣品時(shí)，待測(cè)樣品的用量為0.1-100mg。
12、作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，uplc-esi-hrms掃描方法包括如下步驟：采用配有電噴霧離子源的hrms，通過正相色譜對(duì)糖類化合物進(jìn)行分離，色譜流動(dòng)相采用乙腈和水，乙腈中添加氯親和試劑優(yōu)化，在負(fù)離子-full-ms模式下進(jìn)行掃描。
13、作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，所述乙腈添加氯親和試劑的選擇包括：根據(jù)氯親和試劑的有機(jī)相/水相溶解性及其與糖類化合物發(fā)生親和反應(yīng)的能力，選取糖類氯親和物([m+cl]-)質(zhì)譜靈敏度最高的氯親和試劑及添加濃度。所述的含鹵素親和試劑包括8種季膦鹽(四苯基氯化膦、四丁基氯化膦、甲基三苯基氯化膦、乙基三苯基氯化膦、四苯基溴化膦、氯甲基三苯基氯化膦、四丁基溴化膦、甲基三苯基溴化膦)，13種季銨鹽(苯基三甲基氯化銨、苯基三甲基溴化銨、二甲基芐基苯基氯化銨、n-三乙基-(4-乙烯基芐基)氯化銨、硫化促進(jìn)劑dbu-b、苯扎氯銨、芐基三甲基氯化銨、芐基三丙基氯化銨、芐基三丁基氯化銨、丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨、二甲基苯甲基-2-甲基丙烯酸乙胺酯氯化物、芐索氯銨和十四烷基二甲基芐基氯化銨水合物)和2種無機(jī)銨鹽(氯化銨和溴化銨)；所述的含鹵素親和試劑添加濃度選取1μm。
14、作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，所述優(yōu)化上樣溶液組成包括如下步驟：根據(jù)上樣溶液引起色譜峰溶劑效應(yīng)影響糖類化合物同分異構(gòu)體和旋光異構(gòu)體色譜分離的效果及質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度，優(yōu)化上樣溶液乙腈、甲醇和水的體積比例為2:2:1。
15、作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，所述待測(cè)樣品中糖類化合物的靶向檢測(cè)包括如下步驟：制備目標(biāo)糖類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，通過uplc-esi-hrms進(jìn)行測(cè)定。依據(jù)內(nèi)標(biāo)法(同位素內(nèi)標(biāo)：葡萄糖-13c6)，以內(nèi)標(biāo)校正的峰面積對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)濃度線性回歸分析，計(jì)算待測(cè)樣品中目標(biāo)糖類化合物的濃度。
16、優(yōu)選的，作為一個(gè)較佳的實(shí)施方式，所述質(zhì)譜檢測(cè)條件：離子源為esi源，采用負(fù)離子模式-full-ms模式進(jìn)行全掃描，全掃描質(zhì)量范圍為50-1500da；錐孔電壓為30v；脫溶劑氣溫度為500℃；毛細(xì)管電壓為2.0kv；脫溶劑氣流量為800l/hr；源溫度為100℃。
17、優(yōu)選的，作為一個(gè)較佳的實(shí)施方式，所述色譜分離條件：色譜柱為waters?acquityuplc?beh?amide?column(2.1mm×100mm,1.7μm)，柱溫為40℃；流動(dòng)相選取乙腈(1μm氯甲基三苯基氯化膦)和水，流速為0.3ml/min，進(jìn)樣量為5μl，梯度條件為：0min，95％a；0-3m本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述提取待測(cè)樣品中糖類化合物的具體方法為：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為液體樣品時(shí)，待測(cè)樣品的用量為10-2000μL；所述待測(cè)樣品為固體樣品時(shí)，待測(cè)樣品的用量為0.1-100mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜檢測(cè)條件：離子源為ESI源，采用負(fù)離子模式-full-MS模式進(jìn)行全掃描，全掃描質(zhì)量范圍為50-1500Da；錐孔電壓為30V；脫溶劑氣溫度為500℃；毛細(xì)管電壓為2.0kV；脫溶劑氣流量為800L/Hr；源溫度為100℃；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述乙腈添加氯親和試劑的選擇包括：根據(jù)氯親和試劑的有機(jī)相/水相溶解性及其與糖類化合物發(fā)生親和反應(yīng)
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述優(yōu)化上樣溶液組成包括如下步驟：根據(jù)上樣溶液引起色譜峰溶劑效應(yīng)影響糖類化合物同分異構(gòu)體和旋光異構(gòu)體色譜分離的效果及質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度，優(yōu)化上樣溶液乙腈、甲醇和水的體積比例為2:2:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述對(duì)糖類化合物進(jìn)行含量分析，包括：制備目標(biāo)糖類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，通過UPLC-ESI-HRMS進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)內(nèi)標(biāo)法，同位素內(nèi)標(biāo)：葡萄糖-13C6，以內(nèi)標(biāo)校正的峰面積對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)濃度線性回歸分析，計(jì)算待測(cè)樣品中目標(biāo)糖類化合物的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述對(duì)未知糖類化合物進(jìn)行非靶向鑒定，包括：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述提取待測(cè)樣品中糖類化合物的具體方法為：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為液體樣品時(shí)，待測(cè)樣品的用量為10-2000μl；所述待測(cè)樣品為固體樣品時(shí)，待測(cè)樣品的用量為0.1-100mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜檢測(cè)條件：離子源為esi源，采用負(fù)離子模式-full-ms模式進(jìn)行全掃描，全掃描質(zhì)量范圍為50-1500da；錐孔電壓為30v；脫溶劑氣溫度為500℃；毛細(xì)管電壓為2.0kv；脫溶劑氣流量為800l/hr；源溫度為100℃；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氯增強(qiáng)電離的高靈敏高通量識(shí)別糖類化合物的方法，其特征在于，所述乙腈添加氯親和試劑的選擇包括：根據(jù)氯親和試劑的有機(jī)相/水相溶解性及其與糖類化合物發(fā)生親和反應(yīng)的能力，選取糖類氯親和物([m+cl]-)質(zhì)譜靈敏度最高的氯親和試劑及添加濃度。所述的含鹵素親和試劑包括8種季膦鹽(四苯基氯化膦、四丁基氯化膦、甲基三苯基氯化膦、乙基三苯基氯化膦、四苯基溴化膦、氯甲基三苯...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：萬祎，李聞怡，常紅，崔洪洋，商海林，劉澤華，關(guān)妍，焦玲，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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