【技術實現步驟摘要】
(一)本專利技術屬于生物，特別涉及一種用于特異性診斷前列腺癌的分子標記物及應用。
技術介紹
0、(二)
技術介紹
1、染色體外環狀dna(extrachromosomal?circular?dna，eccdna)是細胞核中存在于染色體外的游離環狀dna，是一種由于基因組不穩定性造成的復雜結構變異，也是多種癌癥的重要分子標記。小的染色體外環狀dna普遍存在于不同組織和細胞中，已有研究報道其在正常組織中的數量及長度特征與癌組織中具有顯著差異，暗示其具有成為癌癥分子標記物的潛力。
2、目前已經有許多eccdna在不同癌癥中的功能研究。zou等發現攜帶有mir-17-92簇的eccdna能夠促進肝癌細胞的增殖和遷移從而促進肝癌的發展(zou?et?al.,hepatology,2023)；jiang等證明了胃癌細胞中過量表達的攜帶增強子或者mirna前體的eccdna能夠促進胃癌的發展(jiang?et?al.,cell?mol.life?sci.,2023)；luo等則通過對25對癌癥病人的癌組織及血漿中eccdna特征分析表明血漿中的eccdna是潛在的臨床分子診斷標記物。
3、eccdna的功能研究是近年來的研究熱點，但多數研究僅限于對不同組織細胞中eccdna的特征進行描述，不能簡單快速的進行eccdna的體外合成是阻礙eccdna功能研究的一大因素。當前對于eccdna的合成方法主要是lama(ligase?assisted?mini-circleaccumulation)技術，其主要原理是根
4、然而，前列腺癌(prostate?cancer，pca)中是否存在在前列腺癌發展中發揮作用的特異的eccdna，同時作為潛在的臨床診斷分子標記物并不清楚。
5、因此，迫切需要開發一種前列腺癌特異的eccdna，及簡單經濟高效的eccdna合成方法以推動eccdna功能的深入研究。
技術實現思路
0、(三)
技術實現思路
1、本專利技術目的是提供一種前列腺癌相關的染色體外環狀dna及作為特異性診斷前列腺癌的分子標記物的應用，本專利技術通過篩選獲得了在前列腺癌中特異性表達的txlna來源染色體外環狀dna，能夠抑制前列腺癌細胞的增殖與遷移，可作為新的前列腺癌臨床診斷分子標記物；本專利技術還提供一種簡單經濟高效的eccdna合成方法。
2、本專利技術采用的技術方案是：
3、本專利技術提供一種前列腺癌相關的染色體外環狀dna，所述染色體外環狀dna包括3條源自txlna蛋白(滑行蛋白α，其結合動力學涉及與突觸素家族成員的c端卷曲螺旋區域的相互作用)的染色體外環狀dna，即txlna?eccdna1、txlna?eccdna2、txlna?eccdna3，核苷酸序列分別如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3所示。
4、本專利技術提供一種特異性檢測所述染色體外環狀dna的引物，所述引物如下：
5、txlna?eccdna1
6、f：5’-cccaagcttcccacctcagcctcccaaagt-3’(seq?id?no.4)，
7、r：5’-cccaagcttcatctgcagctgaatgtcattc-3’(seq?id?no.5)；
8、txlna?eccdna2
9、f：5’-cccaagcttctgcgaagaatttcgaagtctg-3’(seq?id?no.6)，
10、r：5’-cccaagcttgctgccgggaccttctgcttcta-3’(seq?id?no.7)；
11、txlna?eccdna3
12、f：5’-ccttaattaactgcttgccctagtgagttacc-3’(seq?id?no.8)，
13、r：5’-ccttaattaatccacctcagcctcccaaagt-3’(seq?id?no.9)。
14、本專利技術提供一種所述染色體外環狀dna的合成方法，所述方法包括如下步驟：
15、s1、以胚腎細胞系hek293t基因組dna(gdna)為模板，利用所述的引物進行pcr擴增，得到足量的線性dna；
16、擴增反應體系為：2*taq?plus?master?mixii?200μl，f-primer?16μl，r-primer16μl，基因組dna約500ng，ddh2o補至400μl；
17、pcr反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸60s/kb，35循環；72℃延伸5min；4℃保存；
18、s2、用對應的限制性內切酶對s1擴增片段進行酶切；
19、酶切反應體系：5μl?10*reaction?buffer，2μg擴增片段，2μl限制性內切酶，用ddh2o補至50μl；
20、txlna?eccdna3的限制性內切酶為限制性內切酶paci，其余為限制性內切酶hindiii；
21、s3、用t4?dna連接酶將s2酶切片段連接成環；
22、連接反應體系：5μl?10*t4?dna?ligation?buffer，40μl酶切片段，5μl?t4?dna連接酶；
23、s4、用dna外切酶plasmid-safe?dnase對s3連接產物中沒有連接成功的線性dna進行消化，37℃消化16h，得到目標eccdna，分別是txlna?eccdna1(核苷酸序列如seq?id?no.1所示)、txlna?eccdna2(核苷酸序列如seq?id?no.2所示)、txlna?eccdna?3(核苷酸序列如seq?id?no.3所示)；
24、消化反應體系：31μl連接產物，4μl?10*reaction?buffer，1.6μl?25mm?atp，2μlplasmid-safe?dnase，用ddh2o補至40μl。
25、本專利技術還提供一種所述染色體外環狀dna作為特異性診斷前列腺癌分子標記物的應用。
26、所述應用是檢測染色體外環狀dna表達水平，表達水平越高，發生前列腺癌的可能性越高。
27、本專利技術還提供一種所述染色體外環狀dna作為前列腺癌分子標記物的檢測產品，所述檢測產品檢測所述染色體外環狀dna表達水平，所述檢測產品包括試劑盒、芯片或高通量測序平臺。
28、所述試劑盒包括基因檢測試劑盒、蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括pcr試劑盒、rt-pc本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種前列腺癌相關的染色體外環狀DNA，其特征在于，所述染色體外環狀DNA包括源自TXLNA蛋白的TXLNA?eccDNA1、TXLNA?eccDNA2、TXLNA?eccDNA3，核苷酸序列分別如SEQ?IDNo.1、SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.3所示。
2.一種特異性檢測權利要求1所述染色體外環狀DNA的引物，其特征在于，所述引物如下：
3.一種權利要求1所述染色體外環狀DNA的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟S1中，擴增反應體系為：2*Taq?PlusMaster?MixII?200μL，F-Primer?16μL，R-Primer?16μL，基因組DNA500ng，ddH2O補至400μL；
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟S2中，酶切反應體系：5μL?10*Reactionbuffer，2μg擴增片段，2μL限制性內切酶，用ddH2O補至50μL。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟S2中，TXLNA?eccDNA
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟S3中，連接反應體系：5μL?10*T4DNAligation?Buffer，40μL酶切片段，5μL?T4?DNA連接酶。
8.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟S4中，消化反應體系：31μL連接產物，4μL10*Reaction?buffer，1.6μL?25mM?ATP，2μL?Plasmid-safe?DNase，用ddH2O補至40μL。
9.一種權利要求1所述染色體外環狀DNA作為特異性診斷前列腺癌分子標記物的應用。
10.一種權利要求1所述染色體外環狀DNA作為前列腺癌分子標記物的檢測產品。
...【技術特征摘要】
1.一種前列腺癌相關的染色體外環狀dna，其特征在于，所述染色體外環狀dna包括源自txlna蛋白的txlna?eccdna1、txlna?eccdna2、txlna?eccdna3，核苷酸序列分別如seq?idno.1、seq?id?no.2或seq?id?no.3所示。
2.一種特異性檢測權利要求1所述染色體外環狀dna的引物，其特征在于，所述引物如下：
3.一種權利要求1所述染色體外環狀dna的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟s1中，擴增反應體系為：2*taq?plusmaster?mixii?200μl，f-primer?16μl，r-primer?16μl，基因組dna500ng，ddh2o補至400μl；
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟s2中，酶切反應體系：5μl?10*reactionbuffer...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱艷芬，陳生才，周志敏，龔亮，羅金旦，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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