【技術實現步驟摘要】
本申請涉及分子生物學領域中的檢測領域。具體地，本申請涉及一種高效無偏去除微生物樣本(例如，包含微生物的臨床樣本)中宿主核酸(例如，動物源性核酸和/或植物源性核酸)的方法，以及用于實施所述方法的試劑盒。
技術介紹
1、宏基因組學是一種通過對樣本中全部微生物dna(或rna反轉錄而成的cdna)進行高通量測序和生物信息學分析的技術，能夠獲得微生物群落的組成、功能和遺傳多樣性。這項技術在微生態研究方面有廣泛應用，對農業生產、食品安全和人類健康等領域具有重要意義。此外，在病原檢測方面，宏基因組學技術能夠實現病原微生物尤其是新發或罕見病原微生物的快速識別診斷，提高了檢測的靈敏度和準確性，幫助追溯疫情起源、監測疫情發展以及指導臨床精準用藥。
2、然而，許多樣本類型都包含大量的宿主核酸，例如，在人體鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、肺泡灌洗液、腦脊液、陰道拭子等樣本類型中，微生物核酸的比例占核酸總量的比例不足10％，甚至低至0.01％-1％。這導致測序數據中宿主序列遠超微生物序列，大大提高了測序成本和時間成本，增加分析難度，降低微生物檢測的靈敏度，限制了宏基因組的應用。
3、目前去除宿主核酸的方法中，差異離心、甲基化抗體以及pma等方法，不能有效地去除宿主核酸，測序數據中宿主序列比例與去除前沒有顯著差異；流式細胞術、微流控等方法，成本高、(或)操作時間長、容易受到外源微生物污染；差異裂解法，盡管宿主去除效率高，但是水、化學試劑以及額外的離心操作可能同時導致微生物的損失，對微生物群落組成有顯著影響。
4、目前的去除宿
技術實現思路
1、本申請專利技術人基于大量的實驗研究，開發了一種新的去除微生物樣本(如，包含微生物的臨床樣本)中宿主核酸(例如，動物源性核酸和/或植物源性核酸)的方法，所述方法能夠高效去除微生物樣本(如，包含微生物的臨床樣本)中的宿主核酸(例如，動物源性核酸和/或植物源性核酸)，并且操作過程簡便溫和、能最大限度地減少樣本中微生物核酸的損失和降低對不同微生物的偏好性，也即，本申請方法在高效去除宿主核酸的同時，能最大程度保留微生物來源的核酸，并且，本申請方法對樣本中的微生物組成不構成影響，從而能夠有利于宏基因組學分析。
2、因此，在第一方面，本申請提供了一種去除微生物樣本中宿主核酸的方法，其包括以下步驟：
3、(1)提供含有微生物的待處理樣本，所述待處理樣本被懷疑含有宿主核酸；
4、(2)將所述待處理樣本通過濾膜，所述濾膜的孔徑在5-10μm的范圍內；
5、(3)使用核酸酶去除經步驟(2)獲得的樣本中的游離核酸。
6、本領域技術人員易于理解，為避免對微生物的分析結果造成干擾，特異性去除微生物樣本中的宿主核酸是顯著有利的。
7、在某些實施方案中，所述宿主核酸為動物源性核酸和/或植物源性核酸。所述動物源性核酸是指來源于動物的核酸，包括存在于樣本中的動物細胞中的核酸以及樣本中游離的來源于動物的核酸。所述動物可以是人，也可以是其它哺乳動物(例如，家畜(如，豬、牛)、寵物(如，貓、狗)等)。所述植物源性核酸是指來源于植物的核酸，包括存在于樣本中的植物細胞中的核酸以及樣本中游離的來源于植物的核酸。在某些實施方案中，所述植物選自作物或觀賞性植物。在某些實施方案中，所述植物源性核酸是指來源于植物根系的核酸。
8、如本文所使用的，術語“微生物”具有本領域技術人員所通常理解的含義。在某些實施方案中，所述微生物選自細菌、古菌、真菌、放線菌、藻類、病毒、支原體、衣原體及其任意組合。在某些實施方案中，所述微生物選自細菌、古菌、真菌、病毒及其任意組合。在某些實施方案中，所述微生物為細菌。
9、在某些實施方案中，步驟(2)中所述濾膜的孔徑在5-6μm、5-7μm、5-8μm、5-9μm、6-7μm、6-8μm、6-9μm、6-10μm、7-8μm、7-9μm、7-10μm、8-9μm、8-10μm或9-10μm的范圍內。
10、在某些實施方案中，所述濾膜的孔徑為5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm。在某些實施方案中，所述濾膜的孔徑為10μm。
11、在某些實施方案中，步驟(2)中，將所述待處理樣本通過所述濾膜，可有效去除所述待處理樣本中可能存在的動物細胞和/或植物細胞。
12、在某些實施方案中，所述宿主核酸為dna和/或rna。
13、在某些實施方案中，所述宿主核酸為dna。
14、在某些實施方案中，所述宿主核酸為rna。
15、在某些實施方案中，所述方法步驟(3)中，所述核酸酶選自dnase、rnase、全能核酸酶或其任意組合。
16、如本文所用，“全能核酸酶”指能夠在非常廣泛的條件下降解各種形式的(雙鏈，單鏈，線狀，環狀，天然或變性)dna和rna的一類核酸酶。在某些示例性實施方案中，所述全能核酸酶選自benzonase、denarase。
17、在某些實施方案中，所述核酸酶包含turbotmdnase、benzonase、denarase、dnasei、rnase?i、hl-san?dnase或其任意組合。
18、在某些實施方案中，所述核酸酶包含turbotmdnase和benzonase。
19、在某些實施方案中，所述方法步驟(3)中，在25-42℃(例如，37℃)的溫度下，使用所述核酸酶處理經步驟(2)獲得的樣本，以去除所述樣本中的游離核酸。在某些實施方案中，所述方法步驟(3)中，在25-42℃(例如，37℃)的溫度下，使用所述核酸酶處理經步驟(2)獲得的樣本0.5-4h(例如，0.5-3h、2-3h、2-4h、3h)，以去除所述樣本中的游離核酸。
20、在某些實施方案中，所述待處理樣本源自支氣管肺泡灌洗液、口咽拭子樣本、痰液、唾液、血液、血漿、腦脊液、胸腹水、膽汁、膿液、鼻咽拭子樣本、皮膚拭子樣本、陰道拭子樣本、羊水、房水、滑液、尿液、動物組織勻漿液或植物組織勻漿液。
21、需要特別說明的是，本申請專利技術人在研究過程中發現，將樣本溶解于含有甘油的生理鹽水，能夠提高微生物核酸的保留效果、降低對樣本中微生物組成的影響、和/或，提高宿主核酸的去除效果。
22、在某些實施方案中，步驟(1)中，所述待處理樣本含有甘油和氯化鈉。
23、在某些實施方案中，所述待處理樣本中，所述甘油的體積分數為15％-40％(例如，15％-25％、15％-30％、20％-25％、20％-30％、20％-40％、25％-30％、25％-40％、25％)。
24、在某些實施方案中，步驟(1)中，所述待處理樣本中，所述甘油的體積分數為25％。
25、在某些實施方案中，步本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種去除微生物樣本中宿主核酸的方法，其包括以下步驟：
2.權利要求1的方法，其中，步驟(2)中所述濾膜的孔徑在5-6μm、5-7μm、5-8μm、5-9μm、6-7μm、6-8μm、6-9μm、6-10μm、7-8μm、7-9μm、7-10μm、8-9μm、8-10μm或9-10μm的范圍內；
3.權利要求1或2的方法，其中，所述宿主核酸為DNA和/或RNA。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中，步驟(3)中，所述核酸酶選自DNase、RNase、全能核酸酶或其任意組合；
5.權利要求1-4任一項的方法，其中，所述待處理樣本源自支氣管肺泡灌洗液、口咽拭子樣本、痰液、唾液、血液、血漿、腦脊液、胸腹水、膽汁、膿液、鼻咽拭子樣本、皮膚拭子樣本、陰道拭子樣本、羊水、房水、滑液、尿液、動物組織勻漿液或植物組織勻漿液。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中，步驟(1)中，所述待處理樣本含有甘油和氯化鈉；
7.一種提取樣本中微生物的核酸的方法，其包括以下步驟：
8.權利要求7的方法，其中，在步驟(b)之前
9.試劑盒，其包含濾膜以及核酸酶；
10.權利要求1-6任一項的方法、權利要求7或8的方法或權利要求9的試劑盒用于進行宏基因組學分析的用途。
...【技術特征摘要】
1.一種去除微生物樣本中宿主核酸的方法，其包括以下步驟：
2.權利要求1的方法，其中，步驟(2)中所述濾膜的孔徑在5-6μm、5-7μm、5-8μm、5-9μm、6-7μm、6-8μm、6-9μm、6-10μm、7-8μm、7-9μm、7-10μm、8-9μm、8-10μm或9-10μm的范圍內；
3.權利要求1或2的方法，其中，所述宿主核酸為dna和/或rna。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中，步驟(3)中，所述核酸酶選自dnase、rnase、全能核酸酶或其任意組合；
5.權利要求1-4任一項的方法，其中，所述待處理樣本源自支氣管肺泡灌洗液...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李明錕，張莉，王淳，姜旋，
申請(專利權)人：中國科學院北京基因組研究所國家生物信息中心，
類型：發明
國別省市：
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