【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物合成領域，具體涉及去氧青蒿素b合酶(deoxyarteannuin?bsynthase，dbs)及其同工酶a0a2u1ppi9在催化二氫青蒿酸(dihydroartemisinic?acid,dhaa)生物合成二氫去氧青蒿素b(dihydro-epi-deoxyarteannuin?b,dhdb)中的應用。
技術介紹
1、青蒿素(artemisinin,art)，具有優良的抗瘧活性，主要用于間日瘧、惡性瘧的癥狀控制及氯喹耐藥性瘧疾的治療。隨著研究的不斷深入，人們發現art及其類似物具有抗腫瘤、抗炎和免疫調節等多種藥理學作用。如雙氫青蒿素具有干擾表膜和線粒體的功能，對早期系統性紅斑狼瘡具有緩解癥狀和治療的作用；art能夠靶向線粒體蛋白酶lonp1，促進lonp1與其底物cyp11a1的結合，加速cyp11a1的降解，進而抑制卵巢雄激素的合成，降低pcos患者的雄激素水平，改善月經周期及卵巢多囊樣變；青蒿琥酯以md2為靶點，能夠有效抑制心臟成纖維細胞中的纖維化基因表達，抑制其增殖、遷移和收縮，減少膠原蛋白沉積，改善心衰小鼠心臟功能。新型藥理活性的不斷發現，使得art的市場需求逐漸增加。但art在黃花蒿中的含量極低(0.01-1.00％，干重)，雖然已經實現art的化學全合成，但過程復雜，產量低且環境污染嚴重，未能進行工業化生產，所以art的市場供應問題一直備受關注。
2、由于art的終端生物合成途徑未被闡明，仍然不能采用合成生物學的方法直接生產art。zl?202410006829.6通過對黃花蒿轉錄組
技術實現思路
1、鑒于此，本專利技術的目的在于提供去氧青蒿素b合酶及其同工酶a0a2u1ppi9在催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素b中的新應用，為青蒿素的終端生物合成途徑解析提供理論基礎。
2、本專利技術采用的技術方案如下：
3、第一方面，本專利技術提供了去氧青蒿素b合酶(deoxyarteannuin?b?synthase，dbs)或其同工酶a0a2u1ppi9在催化二氫青蒿酸(dihydroartemisinic?acid,dhaa)生物合成二氫去氧青蒿素b(dihydro-epi-deoxyarteannuin?b,dhdb)中的應用。
4、本專利技術通過體外活性驗證發現，dbs及其同工酶a0a2u1ppi9具有催化dhaa生物合成dhdb的功能。
5、本專利技術進一步對dbs進行酶學特性考察，結果顯示，dbs催化dhaa生物合成dhdb的反應時間為1-64h，優選為8-40h，反應溫度為20-60℃，優選為30-60℃；最佳反應時間為24h、最佳反應溫度為50℃，dbs催化dhaa生物合成dhdb的km值為205.17μm，kcat/km值為1.0×10-2min-1.μm-1。
6、本專利技術通過生物信息學分析，發現dbs和a0a2u1ppi9的氨基酸序列具有一定的保守性，即活性酶a0a2u1ppi9是dbs的同工酶。
7、本專利技術所述的同工酶a0a2u1ppi9的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
8、編碼所述的同工酶a0a2u1ppi9的基因，其堿基序列如seq?id?no.2所示。
9、本專利技術所述的同工酶a0a2u1ppi9的異源表達具體在原核生物和真核生物中的異源表達。
10、第二方面，本專利技術還提供了同工酶a0a2u1ppi9在產青蒿素類化合物底盤菌株構建中的應用，所述同工酶a0a2u1ppi9的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
11、第三方面，本專利技術還提供了一種二氫去氧青蒿素b的催化合成方法，以二氫青蒿酸為底物，利用所述的去氧青蒿素b合酶或其同工酶a0a2u1ppi9催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素b。
12、本專利技術與現有技術相比，具有如下優異效果：
13、本專利技術在art的生物合成途徑中，首次公開了dhaa生物合成dhdb的過程，通過生物信息學分析及候選酶的體外活性驗證，表明dbs及其同工酶a0a2u1ppi9均具有催化dhaa生物合成dhdb的新功能，豐富了art生物合成途徑的線路，為art的終端生物合成途徑的解析及art類化合物的異源合成提供理論基礎。
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1.去氧青蒿素B合酶或其同工酶A0A2U1PPI9在催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素B中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述去氧青蒿素B合酶催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素B時的反應時間為1-64?h，優選為8-40?h，反應溫度為20-60℃，優選為30-60℃。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述去氧青蒿素B合酶催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素B的Kcat/Km值為1.0×10-2?min-1.μM-1。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述同工酶A0A2U1PPI9的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，編碼所述的同工酶A0A2U1PPI9的基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO.2所示。
6.根據據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述同工酶A0A2U1PPI9的異源表達具體為在原核生物和真核生物中的異源表達。
7.同工酶A0A2U1PPI9在產青蒿素類化合物底盤菌株構建中的應用，所述同工酶A0A2U1P
8.一種二氫去氧青蒿素B的催化合成方法，其特征在于，以二氫青蒿酸為底物，利用權利要求1所述的去氧青蒿素B合酶或其同工酶A0A2U1PPI9催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素B。
...【技術特征摘要】
1.去氧青蒿素b合酶或其同工酶a0a2u1ppi9在催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素b中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述去氧青蒿素b合酶催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素b時的反應時間為1-64?h，優選為8-40?h，反應溫度為20-60℃，優選為30-60℃。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述去氧青蒿素b合酶催化二氫青蒿酸生物合成二氫去氧青蒿素b的kcat/km值為1.0×10-2?min-1.μm-1。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述同工酶a0a2u1ppi9的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
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