【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)，尤其涉及一種gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定方法。
技術(shù)介紹
1、14-3-3蛋白家族常見于真核生物中，能特異性結(jié)合含磷酸化ser、thr的多肽，并參與多種信號(hào)傳導(dǎo)。14-3-3蛋白還參與調(diào)控多種細(xì)胞生物活動(dòng)，包括細(xì)胞周期、增殖、凋亡等，其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。14-3-3ζ是一種癌基因，在多數(shù)腫瘤中過表達(dá)，可參與腫瘤細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡，遷移和侵襲等過程，可以調(diào)節(jié)多個(gè)癌癥的信號(hào)通路從而影響腫瘤的進(jìn)展。通過sirna對(duì)14-3-3ζ進(jìn)行靶向治療，可以延遲腫瘤的發(fā)展。14-3-3ζ的升高還與不良預(yù)后相關(guān)，影響癌癥患者的生存率。
2、有研究表明，ysk1與gm130的結(jié)合位點(diǎn)位于氨基酸75-271，ysk1在gm130被消耗的細(xì)胞中不能定位于高爾基體，由此可見，ysk1與高爾基體基質(zhì)蛋白gm130的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合并在細(xì)胞中顯示gm130依賴性定位，從而定位于高爾基體，14-3-3ζ是介導(dǎo)ysk1作用的底物。同時(shí)，課題組前期通過免疫組化等試驗(yàn)表明gm130和14-3-3ζ在卵巢上皮惡性腫瘤中均過表達(dá)，且兩者表達(dá)水平呈正相關(guān)。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)查詢，發(fā)現(xiàn)gm130和14-3-3ζ通過結(jié)構(gòu)蛋白sptbn2相連，但具體相互作用尚不明確。
3、現(xiàn)有技術(shù)中的以下幾個(gè)關(guān)鍵問題：
4、1.精確度不足：傳統(tǒng)試驗(yàn)環(huán)境比對(duì)方法常依賴簡(jiǎn)化的數(shù)值計(jì)算或人工分析，缺乏多維數(shù)據(jù)融合，導(dǎo)致比對(duì)結(jié)果的精度不足。
5、2.異構(gòu)數(shù)據(jù)融合不充分：現(xiàn)有方法對(duì)
6、3.智能化水平低：傳統(tǒng)方法依賴人工干預(yù)和經(jīng)驗(yàn)，缺乏自動(dòng)化和智能化的環(huán)境比對(duì)，無法處理大規(guī)模、復(fù)雜的環(huán)境數(shù)據(jù)。
7、4.細(xì)微差異的忽視：傳統(tǒng)方法無法充分捕捉和分析環(huán)境之間的細(xì)微差異，導(dǎo)致等效性評(píng)估的準(zhǔn)確性不足。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本專利技術(shù)提供了一種gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定方法。
2、本專利技術(shù)是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定方法包括：
3、步驟1：使用western?blot和rt-pcr技術(shù)篩選出在skov3/a2780卵巢癌細(xì)胞株中，gm130的蛋白和mrna表達(dá)較高的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
4、步驟2：利用熒光雙染技術(shù)初步檢測(cè)skov3細(xì)胞中g(shù)m130和14-3-3ζ蛋白的空間位置關(guān)系，確認(rèn)二者的共定位；
5、步驟3：將設(shè)計(jì)好的shrna質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)染進(jìn)入skov3細(xì)胞，通過western?blot和rt-pcr技術(shù)篩選出成功敲低gm130表達(dá)的最佳shrna片段；
6、步驟4：使用cck-8試劑盒檢測(cè)不同組別卵巢癌細(xì)胞的增殖情況，評(píng)估gm130對(duì)細(xì)胞增殖的影響；
7、步驟5：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組別卵巢癌細(xì)胞周期的變化，分析gm130敲低對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用；
8、步驟6：通過western?blot分析不同組別中14-3-3ζ、grasp65、p115及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制；
9、其中，所述western?blot、rt-pcr、熒光雙染、cck-8、流式細(xì)胞術(shù)及western?blot檢測(cè)均在自動(dòng)化軟硬件設(shè)備平臺(tái)上進(jìn)行，以確保數(shù)據(jù)的精確性與高通量處理能力。
10、進(jìn)一步，所述步驟1中使用western?blot和rt-pcr技術(shù)篩選出在skov3/a2780卵巢癌細(xì)胞株中，gm130的蛋白和mrna表達(dá)較高的細(xì)胞，并通過對(duì)比分析確保選用的細(xì)胞系具有較高的實(shí)驗(yàn)可靠性。
11、進(jìn)一步，所述步驟2中利用熒光雙染技術(shù)初步檢測(cè)skov3細(xì)胞中g(shù)m130和14-3-3ζ蛋白的空間關(guān)系，通過熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察并拍攝圖像，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
12、進(jìn)一步，所述步驟4中使用cck-8試劑盒檢測(cè)不同組別卵巢癌細(xì)胞的增殖情況，利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(od值)，并通過統(tǒng)計(jì)分析不同組別之間的差異，進(jìn)一步評(píng)估gm130對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
13、本專利技術(shù)還提供了一種基于gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，包括以下模塊：
14、1)細(xì)胞培養(yǎng)模塊，用于培養(yǎng)和處理skov3/a2780卵巢癌細(xì)胞，通過溫控細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液、移液器等設(shè)備進(jìn)行細(xì)胞的生長(zhǎng)、換液、傳代和凍存等操作；
15、2)western?blot與rt-pcr檢測(cè)模塊，用于篩選出在skov3/a2780細(xì)胞株中，gm130蛋白和mrna表達(dá)較高的細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析；
16、3)轉(zhuǎn)染模塊，用于設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染shrna質(zhì)粒片段至skov3細(xì)胞，通過western?blot和rt-pcr篩選出敲低gm130表達(dá)的最佳片段；
17、4)細(xì)胞增殖檢測(cè)模塊，使用cck-8試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)染后不同組別卵巢癌細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，并通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(od值)來評(píng)估細(xì)胞增殖情況；
18、5)流式細(xì)胞術(shù)分析模塊，用于檢測(cè)不同組別卵巢癌細(xì)胞的周期變化，分析gm130敲低對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用；
19、6)westernblot分析模塊，用于檢測(cè)14-3-3ζ、grasp65、p115及增殖相關(guān)蛋白的蛋白水平，進(jìn)一步研究gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
20、進(jìn)一步，所述細(xì)胞培養(yǎng)模塊包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管、超凈臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、廢液收集系統(tǒng)等設(shè)備，所有操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行，并配有自動(dòng)化溫控和培養(yǎng)基更換系統(tǒng)，確保細(xì)胞生長(zhǎng)條件的穩(wěn)定；
21、進(jìn)一步，所述westernblot與rt-pcr檢測(cè)模塊包括westernblot儀器、凝膠電泳系統(tǒng)、pcr儀、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備及相關(guān)試劑，所有實(shí)驗(yàn)流程自動(dòng)化控制，以確保高效和精確的蛋白與基因表達(dá)分析；
22、進(jìn)一步，所述細(xì)胞增殖檢測(cè)模塊使用高通量的酶標(biāo)儀，能夠支持多個(gè)孔板的并行檢測(cè)，并自動(dòng)生成增殖曲線，以提高實(shí)驗(yàn)效率和數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性；
23、進(jìn)一步，所述流式細(xì)胞術(shù)分析模塊包括流式細(xì)胞儀及樣品預(yù)處理系統(tǒng)，能夠自動(dòng)分析不同組別細(xì)胞周期分布，并結(jié)合數(shù)據(jù)處理軟件提供精確的細(xì)胞周期分析結(jié)果，支持多種細(xì)胞分析參數(shù)的高通量檢測(cè)。結(jié)合上述的技術(shù)方案和解決的技術(shù)問題，請(qǐng)從以下幾方面分析本專利技術(shù)所要保護(hù)的技術(shù)方案所具備的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：
24、第一、本專利技術(shù)觀察gm130和14-3-3ζ在人體組織中的表達(dá)關(guān)系，再通過敲低gm130在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，探索14-3-3ζ及相關(guān)蛋白的表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析下調(diào)gm130后卵巢癌細(xì)胞中基因表達(dá)的變化，通過生物信息學(xué)分析初步探究gm130對(duì)14-3-3ζ的影響及分子機(jī)制，為接下來卵巢癌的診斷和治療尋找潛在靶點(diǎn)。<本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，包括以下模塊：
2.如權(quán)利要求1所述的GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)模塊包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管、超凈臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、廢液收集系統(tǒng)等設(shè)備，所有操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行，并配有自動(dòng)化溫控和培養(yǎng)基更換系統(tǒng)，確保細(xì)胞生長(zhǎng)條件的穩(wěn)定。
3.如權(quán)利要求1所述的GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，所述Western?blot與RT-PCR檢測(cè)模塊包括Western?blot儀器、凝膠電泳系統(tǒng)、PCR儀、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備及相關(guān)試劑，所有實(shí)驗(yàn)流程自動(dòng)化控制，以確保高效和精確的蛋白與基因表達(dá)分析。
4.如權(quán)利要求1所述的GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞增殖檢測(cè)模塊使用高通量的酶標(biāo)儀，能夠支持多個(gè)孔板的并行檢測(cè)，并自動(dòng)生成增殖曲線，以提高實(shí)驗(yàn)效率和數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。
5.如權(quán)利要求1所述的GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增
6.一種GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.如權(quán)利要求1所述GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟1中使用Western?blot和RT-PCR技術(shù)篩選出在SKOV3/A2780卵巢癌細(xì)胞株中，GM130的蛋白和mRNA表達(dá)較高的細(xì)胞，并通過對(duì)比分析確保選用的細(xì)胞系具有較高的實(shí)驗(yàn)可靠性。
8.如權(quán)利要求6所述的GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟2中利用熒光雙染技術(shù)初步檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中GM130和14-3-3ζ蛋白的空間關(guān)系，通過熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察并拍攝圖像，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
9.如權(quán)利要求6所述的GM130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟4中使用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同組別卵巢癌細(xì)胞的增殖情況，利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(OD值)，并通過統(tǒng)計(jì)分析不同組別之間的差異，進(jìn)一步評(píng)估GM130對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，包括以下模塊：
2.如權(quán)利要求1所述的gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)模塊包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管、超凈臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、廢液收集系統(tǒng)等設(shè)備，所有操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行，并配有自動(dòng)化溫控和培養(yǎng)基更換系統(tǒng)，確保細(xì)胞生長(zhǎng)條件的穩(wěn)定。
3.如權(quán)利要求1所述的gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，所述western?blot與rt-pcr檢測(cè)模塊包括western?blot儀器、凝膠電泳系統(tǒng)、pcr儀、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備及相關(guān)試劑，所有實(shí)驗(yàn)流程自動(dòng)化控制，以確保高效和精確的蛋白與基因表達(dá)分析。
4.如權(quán)利要求1所述的gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞增殖檢測(cè)模塊使用高通量的酶標(biāo)儀，能夠支持多個(gè)孔板的并行檢測(cè)，并自動(dòng)生成增殖曲線，以提高實(shí)驗(yàn)效率和數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。
5.如權(quán)利要求1所述的gm130通過14-3-3ζ對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響的測(cè)定系統(tǒng)，其特征在于，所述流式細(xì)胞術(shù)分析模塊包括流式細(xì)胞儀及樣品預(yù)處理系...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭依果，羅祎，易永芬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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