【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及滇牡丹組織培養(yǎng)，具體涉及一種滇牡丹種胚叢生芽誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
1、滇牡丹(paeonia?delavayi?franch)是分布于我國(guó)西南高海拔嚴(yán)寒地區(qū)的國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，擁有豐富且多樣的花色和葉形，極具觀賞價(jià)值，可作為專(zhuān)類(lèi)園、花壇、花鏡和花帶等形式應(yīng)用于園林綠化中，打造優(yōu)美的城市景觀，需要大量的種苗才能實(shí)現(xiàn)。經(jīng)由種子繁育的幼苗存在時(shí)間長(zhǎng)、效率低、出苗率不高、表型分化大等缺點(diǎn)，無(wú)法滿(mǎn)足規(guī)模化生產(chǎn)與育種的要求，成為始終困擾滇牡丹的推廣使用的制約之一；且牡丹組植物上下胚軸雙重休眠特點(diǎn)導(dǎo)致其自然更新能力弱，嚴(yán)重制約其種群數(shù)量的增加和優(yōu)良性狀的傳承。
2、植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立高效的遺傳再生體系是實(shí)現(xiàn)基因工程培育新品種方法的最重要的基礎(chǔ)工作，其受時(shí)間與空間的限制小，能夠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)繁的目的，母本的優(yōu)良性狀也得以保持且變異系數(shù)不大，能為牡丹育種和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。‘鳳丹’牡丹、芍藥、大花黃牡丹等均有使用種胚通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)途徑或叢生芽誘導(dǎo)途徑成功建立完整再生體系的報(bào)道，但是關(guān)于滇牡丹的種胚研究?jī)H停留在愈傷組織增殖階段，未見(jiàn)不定芽的分化，葉柄與雄蕊的組織培養(yǎng)也僅實(shí)現(xiàn)愈傷組織的增殖，此外未見(jiàn)關(guān)于叢生芽誘導(dǎo)的相關(guān)研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種滇牡丹種胚叢生芽誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法，使用當(dāng)年新鮮成熟的滇牡丹種子中的種胚為外植體，通過(guò)種胚叢生芽誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基的研究，初步建立種胚叢生芽誘導(dǎo)途徑的再生體系，為滇牡丹遺傳轉(zhuǎn)
2、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
3、一種滇牡丹種胚叢生芽誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
4、s1、外植體的獲取：將滇牡丹種子采用赤霉素溶液浸泡處理后洗凈，再解剖出完整的種胚進(jìn)行消毒處理，得外植體備用；
5、s2、種胚的萌發(fā)培養(yǎng)：將上述外植體接種至萌發(fā)培養(yǎng)基中，在黑暗條件下培養(yǎng)獲得胚苗；且萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為：ms+0.2mg/lga3+0.5g/lpvp+7g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
6、s3、種胚叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述胚苗接種至叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)出多個(gè)叢生芽；且叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：ms+0.5mg/l?kt+0.5mg/l?6-ba+30g/l蔗糖+7g/l瓊脂+0.5g/lpvp+20mg/l異硫氰酸乙酯+30mg/l茶皂素；
7、s4、叢生芽的增殖培養(yǎng)：將上述誘導(dǎo)出多個(gè)叢生芽的胚苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，至叢生芽增殖達(dá)2倍以上；且增殖培養(yǎng)基的配方為：ms+0.2mg/l?ga3+0.5mg/l?kt+0.5mg/l?6-ba+0.3g/l?ch+30g/l蔗糖+7g/l瓊脂+1g/l?pvp+15mg/l生育酚乙酸酯；
8、s5、叢生芽生根培養(yǎng)：將上述步驟s4中獲得的叢生芽接種至叢生芽生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獲得滇牡丹幼苗；且叢生芽生根培養(yǎng)基的配方為改良1/2ms+1mg/l?iba+0.2mg/l?naa+0.5mg/l?iaa+7g/l瓊脂+1g/l?pvp+2g/lac+15mg/l異硫氰酸乙酯+30mg/l生育酚乙酸酯；且改良1/2ms的配方為：720mg/lkno3、580mg/lnh4no3、106mg/lkh2po4、146mg/lmgso4·7h2o、255mg/l?cacl2·2h2o、0.83mg/lki、6.2mg/l?h3bo3、22.3mg/lmnso4·h2o、8.6mg/lznso4·7h2o、0.25mg/l?na2moo4·2h2o、0.025mg/l?cuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2·6h2o、27.6mg/ledta-na2、30.5mg/lfeso4·7h2o、100mg/l肌醇、3.5mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l鹽酸吡哆醇；
9、s6、煉苗移栽：挑選上述s4中生長(zhǎng)健壯的滇牡丹幼苗，移出培養(yǎng)箱馴化2d后，去除根部叢生芽生根培養(yǎng)基，移栽至生長(zhǎng)基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。
10、優(yōu)選的，所述步驟s1中滇牡丹種子采用赤霉素溶液浸泡的方式為將滇牡丹種子浸泡于500mg/l的赤霉素溶液中48-50h。
11、優(yōu)選的，所述步驟s1中滇牡丹種子消毒處理的方式為采用質(zhì)量濃度為0.4％-0.5％的次氯酸鈉溶液浸泡處理5-6min，后無(wú)菌水沖洗2-3次。
12、優(yōu)選的，所述步驟s2中種胚的萌發(fā)培養(yǎng)的條件為25±2℃黑暗培養(yǎng)。
13、優(yōu)選的，所述步驟s3中叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度條件為15±1℃，且培養(yǎng)過(guò)程中先進(jìn)行暗培養(yǎng)，再控制每日光照時(shí)間為16h進(jìn)行補(bǔ)光培養(yǎng)，且所述暗培養(yǎng)的時(shí)間為10d，所述補(bǔ)光培養(yǎng)時(shí)采用白色led燈光為光源。
14、優(yōu)選的，所述步驟s4中所述叢生芽的增殖培養(yǎng)的溫度為25±2℃，且采用白色led燈控制光照時(shí)間為16h/d。
15、優(yōu)選的，所述步驟s5中叢生芽生根培養(yǎng)的溫度為20±1℃，且采用白色led燈控制光照時(shí)間為16h/d。
16、優(yōu)選的，所述步驟s6中生長(zhǎng)健壯的滇牡丹幼苗的標(biāo)準(zhǔn)為苗高＞8cm，根長(zhǎng)＞5cm，須根數(shù)＞3條。
17、優(yōu)選的，所述步驟s6中生長(zhǎng)基質(zhì)為按照質(zhì)量比為腐殖質(zhì)：紅土：珍珠巖＝1:1:1的基質(zhì)或腐殖質(zhì)：珍珠巖＝1:0.5的基質(zhì)中的任意一種，且生長(zhǎng)基質(zhì)使用前一天于121℃高溫高壓滅菌20min后自然冷卻后使用。
18、優(yōu)選的，所述步驟s6中移栽至生長(zhǎng)基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)的條件為在28±2℃中光照培養(yǎng)，控制每天光照16h，且移栽前7d遮蓋透明塑料罩。
19、本專(zhuān)利技術(shù)提供一種滇牡丹種胚叢生芽誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)在于：
20、本專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)對(duì)滇牡丹的種胚采用叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、叢生芽生根培養(yǎng)基依次培養(yǎng)能夠建立種胚叢生芽誘導(dǎo)途徑的再生體系，能夠獲得完整的滇牡丹植株，便于滇牡丹的繁育，并且保證誘導(dǎo)的滇牡丹根系健康生長(zhǎng)，提升后續(xù)移栽的成活率。
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1.一種滇牡丹種胚叢生芽誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S1中滇牡丹種子采用赤霉素溶液浸泡的方式為將滇牡丹種子浸泡于500mg/L的赤霉素溶液中48-50h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S1中滇牡丹種子消毒處理的方式為采用質(zhì)量濃度為0.4％-0.5％的次氯酸鈉溶液浸泡處理5-6min，后無(wú)菌水沖洗2-3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S2中種胚的萌發(fā)培養(yǎng)的條件為25±2℃黑暗培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S3中叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度條件為15±1℃，且培養(yǎng)過(guò)程中先進(jìn)行暗培養(yǎng)，再控制每日光照時(shí)間為16h進(jìn)行補(bǔ)光培養(yǎng)，且所述暗培養(yǎng)的時(shí)間為10d，所述補(bǔ)光培養(yǎng)時(shí)采用白色LED燈光為光源。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S4中所述叢生芽的增殖培養(yǎng)的溫度為25±2℃，且采用白色LED燈控制光照時(shí)間為16h/d。
<...【技術(shù)特征摘要】
1.一種滇牡丹種胚叢生芽誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s1中滇牡丹種子采用赤霉素溶液浸泡的方式為將滇牡丹種子浸泡于500mg/l的赤霉素溶液中48-50h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s1中滇牡丹種子消毒處理的方式為采用質(zhì)量濃度為0.4％-0.5％的次氯酸鈉溶液浸泡處理5-6min，后無(wú)菌水沖洗2-3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s2中種胚的萌發(fā)培養(yǎng)的條件為25±2℃黑暗培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s3中叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度條件為15±1℃，且培養(yǎng)過(guò)程中先進(jìn)行暗培養(yǎng)，再控制每日光照時(shí)間為16h進(jìn)行補(bǔ)光培養(yǎng)，且所述暗培養(yǎng)的時(shí)間為10d，所述補(bǔ)光培養(yǎng)時(shí)采用白色le...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王娟，牟亞萍，趙玲，潘悅，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：西南林業(yè)大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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