【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)，具體涉及一種脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、在治療傳染性疾病的方法中，疫苗是最重要的專利技術(shù)之一，大大降低了傳染性疾病的發(fā)病率和死亡率。在許多國(guó)家和地區(qū)，疫苗降低了99%的傳染病死亡率，例如天花、脊髓灰質(zhì)炎、白喉和麻疹，目前上市的疫苗主要有減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗等。由于基于全病原體的減毒疫苗和滅活疫苗具有諸多安全性隱患和無效免疫反應(yīng)，隨著對(duì)病原體的生活周期、遺傳特點(diǎn)、致病機(jī)理等的深入研究，疫苗抗原的選擇和設(shè)計(jì)從全病原體抗原過度到某一種或幾種明確的保護(hù)性組分，進(jìn)入亞單位疫苗時(shí)代。亞單位疫苗安全性優(yōu)異，但免疫原性較弱，抗原易被清除，因此選擇合適的抗原及抗原設(shè)計(jì)方案、免疫刺激物和抗原遞送系統(tǒng)是亞單位疫苗成功的關(guān)鍵因素。
2、細(xì)菌脂蛋白是一類通過脂肪酸鏈結(jié)合在膜上的脂肪酸修飾蛋白，細(xì)菌脂蛋白的體內(nèi)合成是在信號(hào)肽的引導(dǎo)下完成的，細(xì)菌脂化信號(hào)肽由n端正電荷區(qū)、中段疏水區(qū)和c端脂化保守序列[lvi][astvi][gas][c]等三個(gè)區(qū)域構(gòu)成，其中，c端的半胱氨酸是脂化修飾位點(diǎn)；在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，目的蛋白經(jīng)sec或tat分泌途徑分泌至細(xì)胞膜外側(cè)，lgt酶以磷脂酰甘油（pg，phosphatidylglycerol）為底物，將二酰基甘油連接至半胱氨酸（cys）的巰基上，lspa酶切除信號(hào)肽除c端cys外的部分，lnt酶可以磷脂酰乙醇胺（pe）為底物將另一條脂肪酸鏈轉(zhuǎn)移至cys的氨基上。
3、白喉毒素是一種由白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生的外毒素，具有高度的生物活性和毒性，毒素通過與宿主
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原及其應(yīng)用，特別是用于制備白喉毒素疫苗，尤其是呼吸道免疫疫苗中的應(yīng)用。
2、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第一方面，提供一種脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原。
3、進(jìn)一步地，所述脂肪酸化修飾包含脂肪酸化修飾的n-末端半胱氨酸(cys)。
4、更進(jìn)一步地，所述脂肪酸化修飾為n-末端半胱氨酸cys巰基被含有脂肪酸鏈殘基的二酰基甘油修飾和/或脂肪酸鏈酰基化修飾。
5、優(yōu)選地，所述脂肪酸鏈為包含c16-c18碳原子的長(zhǎng)鏈脂肪酸。
6、優(yōu)選地，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原為無毒突變體crm197。
7、更優(yōu)選地，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原包括保留與白喉毒素具有相同功能的變異體。所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原包括如seq?id?no.1所示的33-566氨基酸序列。
8、進(jìn)一步地，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原為多聚體。
9、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第二方面，提供一種制備上述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原的方法，所述方法包括在大腸桿菌中表達(dá)包含脂肪酸化修飾信號(hào)肽的所述白喉毒素蛋白基因，純化制備含脂肪酸化修飾的白喉毒素蛋白的步驟。其中，所述信號(hào)肽含有n端正電荷區(qū)、中段疏水區(qū)和c端脂化保守序列[lvi][astvi][gas][c]三個(gè)區(qū)域。優(yōu)選地，所述信號(hào)肽為seq?id?no.3的氨基酸序列。進(jìn)一步地，所述c端的半胱氨酸是脂肪酸化修飾位點(diǎn)。
10、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第三方面，提供一種如上所述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原在制備能引起動(dòng)物產(chǎn)生抗原特異性抗體的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述免疫組合物可以通過肌肉注射或皮下注射、或滴鼻免疫、或霧化免疫。優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為疫苗。
11、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第四方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含上述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原。
12、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第五方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含編碼上述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原的核酸。
13、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第六方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含編碼上述脂肪酸化修飾白喉毒素抗原的載體。
14、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第七方面，提供一種生物材料，所述生物材料為下述任一種：
15、c1)編碼權(quán)利要求1-8任一所述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原的核酸分子；
16、c2)含有c1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
17、c3)含有c1)所述核酸分子的重組載體、或含有c2)所述表達(dá)盒的重組載體；
18、c4)含有c1)所述核酸分子的重組微生物、或含有c2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有c3)所述重組載體的重組微生物；
19、c5)含有c1)所述核酸分子的重組細(xì)胞、或含有c2)所述表達(dá)盒的重組細(xì)胞、或含有c3)所述重組載體的重組細(xì)胞。
20、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第八方面，提供一種利用上述脂肪酸化修飾白喉毒素抗原制備疫苗的方法。
21、依據(jù)本專利技術(shù)技術(shù)方案的第九方面，提供一種利用上述的生物材料制備疫苗的方法。
22、本專利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，至少具有如下有益效果：
23、1、本專利技術(shù)提供了一種脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原可以聚合為納米顆粒，顯著提高了其免疫原性，將其作為肌肉注射疫苗的主要成分，顯著提高了粘膜免疫效果，可誘導(dǎo)出特異性igg的抗體，具有極高的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用前景。
24、2、本專利技術(shù)公開的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，肌肉注射免疫動(dòng)物，兩次免疫可產(chǎn)生高滴度的igg結(jié)合抗體；呼吸道免疫接種動(dòng)物，三次免疫后可在檢測(cè)到的白喉毒素特異性igg結(jié)合抗體。
25、3、與現(xiàn)有白喉毒素蛋白抗原相比，該抗原不僅具有常規(guī)肌肉注射誘導(dǎo)更快、更高免疫保護(hù)的作用，還可誘導(dǎo)呼吸道粘膜免疫，為在感染位點(diǎn)阻斷白喉毒素的感染及擴(kuò)散傳播，提供全方位的免疫保護(hù)提供基礎(chǔ)。
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1.一種脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，其含有脂肪酸化修飾的N-末端半胱氨酸(Cys)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾為N-末端半胱氨酸Cys具體為Cys的巰基被二脂酰基甘油修飾，或Cys的巰基被二脂酰基甘油修飾且α-氨基被脂酰基修飾。。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂酰基碳鏈長(zhǎng)度為C16～C18。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原為無毒突變體CRM197。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原包括保留與白喉毒素具有相同功能的變異體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原包括如SEQ?ID?NO.1所示的33-566氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的脂肪酸化修
9.一種制備權(quán)利要求1-7任一所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原的方法，其特征在于，所述方法包括在大腸桿菌中表達(dá)包含脂肪酸化修飾信號(hào)肽的所述白喉毒素蛋白基因，純化制備含脂肪酸化修飾的白喉毒素蛋白的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)肽含有N端正電荷區(qū)、中段疏水區(qū)和C端脂化保守序列[LVI][ASTVI][GAS][C]三個(gè)區(qū)域。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)肽為SEQ?ID?NO.3的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述C端的半胱氨酸是脂肪酸化修飾位點(diǎn)。
13.一種如權(quán)利要求1-8任一所述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原在制備能引起動(dòng)物產(chǎn)生抗原特異性抗體的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述免疫組合物可以通過肌肉注射或皮下注射、或滴鼻免疫、或霧化免疫。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品為疫苗。
15.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-8任一所述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原。
16.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含編碼權(quán)利要求1-8任一所述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原的核酸。
17.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含編碼權(quán)利要求1-8任一所述的脂肪酸化修飾白喉毒素抗原的載體。
18.生物材料，其特征在于，所述生物材料為下述任一種：
19.一種利用權(quán)利要求1-8任一所述脂肪酸化修飾白喉毒素抗原制備疫苗的方法。
20.一種利用權(quán)利要求18所述的生物材料制備疫苗的方法。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，其含有脂肪酸化修飾的n-末端半胱氨酸(cys)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾為n-末端半胱氨酸cys具體為cys的巰基被二脂酰基甘油修飾，或cys的巰基被二脂酰基甘油修飾且α-氨基被脂酰基修飾。。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂酰基碳鏈長(zhǎng)度為c16～c18。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原為無毒突變體crm197。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原包括保留與白喉毒素具有相同功能的變異體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原包括如seq?id?no.1所示的33-566氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原，其特征在于，所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原為多聚體。
9.一種制備權(quán)利要求1-7任一所述脂肪酸化修飾的白喉毒素抗原的方法，其特征在于，所述方法包括在大腸桿菌中表達(dá)包含脂肪酸化修飾信號(hào)肽的所述白喉毒素蛋白基因，純化制備含脂肪酸化修...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉波，吳軍，孫鵬，王乾，王甜甜，張斌，侯旭宸，王涵，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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