【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及拉沙病毒疫苗，具體涉及一種拉沙病毒gpc融合前構象突變體蛋白及其應用。本申請請求申請日為2024年11月27日的中國專利技術專利申請202411712983.1的優先權。
技術介紹
1、拉沙病毒（lassa?virus?，lasv）是導致拉沙熱（lassa?fever，lf）的病原體，主要在西非地區流行。拉沙熱是一種病毒性出血熱，會導致感染者嚴重的多器官衰竭、出血甚至死亡，對病毒流行地區人們的健康造成較大危害。估計每年有?10萬到30?萬人感染?lasv，其中?5000?~10000?人死于該疾病。目前沒有?fda?批準的明確用于治療拉沙熱的疫苗或抗病毒藥物(nat?rev?microbiol?21(2):87-96(2023))。
2、拉沙熱疫苗的研發任務已被列入世衛組織需要緊急研究和開發的重點疾病研發計劃。拉沙熱疫苗的研究雖然取得了一些進展，但仍處于不斷探索的階段。目前，有許多不同形式的拉沙熱候選疫苗在動物模型中顯示出對病毒感染的一定保護作用，包括dna疫苗(hum?vaccines?immunotherapy?2019.?15:2066–2074?)、rna疫苗(nat?communication2023.14(1):5603)、減毒活疫苗和病毒載體疫苗(npj?vaccines?4:8(2019))，然而尚無疫苗獲批使用。
3、拉沙病毒屬于沙粒病毒科沙粒病毒屬，病毒粒子通常為圓形或橢圓形，直徑約80-150?nm。病毒粒子由核衣殼和包膜組成。核衣殼呈螺旋對稱結構，包含病毒的遺傳物質。
4、天然狀態下gpc以三聚體形式展示在病毒表面。gpc結構不穩定，易自發由高能級融合前構象向低能級融合后構象。根據多項gpc結構研究發現，大多數已知的拉沙病毒中和抗體靶向跨多個不連續結構域的構象表位，重組表達的gpc抗原迅速解離成單體，導致中和抗體表位破壞，同時會暴露多個免疫優勢的三聚體內部非中和抗體表位。gpc結構不穩定，易發生變構，表面糖基化復雜，以及，存在多種拉沙病毒株，為廣譜拉沙熱疫苗抗原結構設計帶來一定的困難(nature?603:174–179?(2022);science?356:923–928?(2017))。
5、本專利技術的目的是提供一種gpc變異體，所述變異體能夠提供穩定gpc融合前構象及展示廣譜中和抗體表位。
技術實現思路
1、基于上述目的，本專利技術首先提供了一種拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體。拉沙病毒gpc蛋白包括兩個亞單位gp1和gp2。野生型gpc蛋白的結構不穩定，影響免疫原的效果。本專利技術所述的拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體在野生型沙病毒gpc蛋白（seq?idno.1）的基礎上的突變位置包括：以（g4s）3柔性連接肽替換gp1和gp2之間的s1p位點，并在gp2氨基酸序列中的326-333構象不穩定的松散區域處引入了脯氨酸突變。
2、在本專利技術的一個具體實施方案中，所述拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體的氨基酸序列如seq?id?no:2所示，并將該gpc突變體命名為“gpcv1”。
3、在gpcv1突變的基礎上，本專利技術所述的拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體的突變位置還包括在gp2的c-末端添加一個三聚基序t4?fib（序列如seq?id?no.6所示），從而提供了一種拉沙病毒gpc三聚體融合前構象抗原變異體，所述突變體以三聚體或多聚體形式存在。
4、在本專利技術的一個具體實施方案中，所述拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體的氨基酸序列如seq?id?no:4所示，所述突變體在本專利技術中被命名為“gpcv2”。
5、其次，本專利技術提供了一種編碼上述的拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體的dna分子，在一個可選的實施方案中，所述dna分子是通過密碼子優化的dna分子，其中，gpcv1的序列如seq?id?no:3所示，gpcv2的序列如seq?id?no:5所示。
6、第三，本專利技術提供了一種根據上述的dna分子轉錄獲得的mrna分子。
7、第四，本專利技術提供了一種含有上述的dna分子的載體，所述載體用以荷載、復制、表達所述dna分子。所述載體可以為原核細胞表達載體、可以為真核細胞表達載體，也可以為病毒載體。在本專利技術的一個具體實施方案中，所述載體為真核細胞表達載體pcdna?3.1，本專利技術的一個具體構建策略為：將編碼所述的?gpc?突變體的氨基酸序列n?端添加?tpa?序列，在編碼所述?gpc?突變體的dna序列?5’啟動密碼子?atg?附近加入?kozak?序列，通過酶切位點將基因連接至真核表達載體pcdna?3.1。
8、在本專利技術一個可選的實施方案中，所述載體為慢病毒載體。本專利技術通過使用慢病毒載體包裝系統在?env?缺陷、表達熒光素酶的無復制能力的人類免疫缺陷病毒（hiv）-1骨架中獲得了攜帶全長?gpc?的拉沙病毒假病毒。
9、第五，本專利技術提供了含有上述dna分子的宿主細胞。在本專利技術的一個具體實施方案中，使用上述構建的真核表達載體pcdna?3.1載體轉化入真核細胞expi293f表達并純化抗原蛋白，獲得了拉沙病毒gpc三聚體融合前構象變異體。
10、在本專利技術的另一個具體實施方案中，使用上述的慢病毒包裝系統，將含有拉沙病毒gpc編碼基因的載體pdc316-lasv-gpc?和輔助質粒?pnl4-3.luc-r-e?共轉染到?293t?細胞中，在?48?和?72?小時收獲攜帶全長?gpc?的拉沙病毒假病毒。
11、第六，本專利技術提供了上述的拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體的單體或者多聚體在制備拉沙熱治療、預防藥物或者疫苗中的應用。
12、本專利技術通過?expi293f?細胞表達，經過純化后成功制備了拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體。將該突變體和鋁佐劑及?cpg?聯用免疫小鼠，并進行血清抗體檢測。實驗結果表明，三聚體形式的突變體?gpcv2?和多數為單體形式的突變體?gpcv1?相比，能夠顯著提升針對拉沙病毒gpc中和抗體水平。
13、通過與鋁佐劑及?cpg?聯用免疫小鼠后進行評價，實驗結果表明，gpcv2免疫后抗體滴度能達到?106，約為?gpcv1激發抗體滴度的100?倍，抗體亞類igg1?和?igg2a?也在免疫兩針后顯著高于?gpcv1?組。聯合其他佐劑，針對?gp1?的抗體也顯著高于對照?gpcv1。
14、在所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.?一種拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體在氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的野生型沙病毒GPC蛋白的基礎上的突變位置包括：以（G4S）3柔性連接肽替換GP1和GP2之間的S1P位點，并在GP2氨基酸序列中的326-333構象不穩定的松散區域處引入脯氨酸突變。
2.?根據權利要求1所述的拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。
3.根據權利要求1所述的拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體的突變位置還包括在GP2的C-末端添加一個三聚基序。
4.?根據權利要求3所述的拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。
5.?一種編碼權利要求2或4所述的拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的序列如SEQ?ID?
6.一種根據權利要求5所述的DNA分子轉錄獲得的mRNA分子。
7.一種含有權利要求5所述的DNA分子的載體。
8.根據權利要求7所述的載體，其特征在于，所述載體為慢病毒載體。
9.一種含有權利要求7所述載體的宿主細胞。
10.權利要求2或4所述的拉沙病毒GPC蛋白的融合前構象變異體在制備拉沙熱治療、預防藥物或者疫苗中的應用。
11.?權利要求5所述的DNA在制備拉沙熱?DNA疫苗中的應用。
12.?權利要求6所述的mRNA?在制備拉沙熱?mRNA?疫苗中的應用。
...【技術特征摘要】
1.?一種拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的野生型沙病毒gpc蛋白的基礎上的突變位置包括：以（g4s）3柔性連接肽替換gp1和gp2之間的s1p位點，并在gp2氨基酸序列中的326-333構象不穩定的松散區域處引入脯氨酸突變。
2.?根據權利要求1所述的拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。
3.根據權利要求1所述的拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體的突變位置還包括在gp2的c-末端添加一個三聚基序。
4.?根據權利要求3所述的拉沙病毒gpc蛋白的融合前構象變異體，其特征在于，所述拉沙病毒gpc...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李汭樺，徐俊杰，宰曉東，王少巖，張軍，李耀輝，張躍，王瀟霖，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，
類型：發明
國別省市：
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