【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及prssv疫苗，尤其是涉及一種高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、納米抗體（nb）是一種源自駱駝、羊駝等動(dòng)物hcabs可變結(jié)構(gòu)域的單域抗體，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生物相容性好、滲透性強(qiáng)，能夠穿透血腦屏障，能訪問(wèn)深層隱藏目標(biāo)的特點(diǎn)，在探尋新藥靶點(diǎn)等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，在臨床診斷及治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但是其體積特性也有弊端，體積小容易被腎臟快速濾出體外，導(dǎo)致納米抗體在機(jī)體內(nèi)滯留時(shí)短，嚴(yán)重影響其治療效果。
2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（prssv）有8種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為gp2、e、gp3、gp4、gp5、m、n、orf5a，研究表明nsp2、gp5和m蛋白均具有prssv的中和抗體的靶點(diǎn)，而且gp5和m蛋白與豬免疫系統(tǒng)對(duì)prssv的清除有關(guān)。gp5的本質(zhì)是一種糖基化囊膜蛋白，根據(jù)gp5的位置結(jié)構(gòu)，將其分為信號(hào)肽區(qū)域、膜外區(qū)、3次跨膜區(qū)和c末端的膜內(nèi)區(qū)。其中在gp5的膜外區(qū)中和表位之前存在一個(gè)誘騙性非中和表位，可對(duì)豬體免疫系統(tǒng)屏蔽，使得機(jī)體對(duì)中和表位產(chǎn)生的特異性反應(yīng)降低，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)prssv的識(shí)別和清除效率大幅降低。2019年，科研人員以gp5為抗原，制備的針對(duì)prssv的亞單位疫苗，正是此原因?qū)е旅庖邉?dòng)物雖然產(chǎn)生特異抗體，但其對(duì)機(jī)體的保護(hù)率并不理想。此外，prssv作為單股正鏈rna病毒，與dna病毒相比，缺少?gòu)?fù)制環(huán)節(jié)的校對(duì)機(jī)制，變異速率更快，且具有復(fù)雜的感染及免疫逃逸機(jī)制，prssv的新型疫苗研制面臨巨大挑戰(zhàn)，迫切需要研究抗病毒感染的新策略。
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1、本專利技術(shù)的目的是提供一種高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體及其制備方法和應(yīng)用，以為開(kāi)發(fā)特異性反應(yīng)高、保護(hù)率高、與抗原親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的prssv疫苗提供一種納米抗體及制備方法。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供一種高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體，所述高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體為nb7，nb7的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，氨基酸序列如seq?idno.6所示。
3、一種如上所述的高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體的制備方法，步驟如下：
4、s1、將prssv-gp5抗原采用多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)體況良好、免疫前半年未進(jìn)行免疫接種的、成年雄性羊駝進(jìn)行4次免疫；
5、s2、分離被免疫羊駝外周血淋巴細(xì)胞，提取rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，以獲得的cdna為模板進(jìn)行兩輪巢式pcr擴(kuò)增，將pcr產(chǎn)物電泳后切膠回收獲得vhh片段；
6、s3、采用sfii酶分別對(duì)pcantab?5e載體和vhh片段進(jìn)行酶切，然后連接獲得pcantab?5e-?vhh重組載體；
7、s4、將pcantab?5e-?vhh重組載體轉(zhuǎn)入er2738細(xì)胞，涂布于2×ytag固體培養(yǎng)板上，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日收集菌落獲得pcantab5e-nb-gp5初級(jí)文庫(kù)；
8、s5、采用輔助噬菌體m13k07對(duì)構(gòu)建的pcantab5e-nb-gp5初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行拯救，獲得噬菌體展示文庫(kù)；
9、s6、采用不同濃度的prssv-gp5蛋白對(duì)噬菌體展示文庫(kù)進(jìn)行4輪淘篩后，選取吸光值最高的陽(yáng)性克隆菌液送公司測(cè)序，獲得prssv-gp5特異性納米抗體序列—nb7。
10、優(yōu)選的，s1中分別于羊駝背部皮下進(jìn)行免疫；prssv-gp5抗原注射量為200μg/次，初次免疫使用完全弗氏佐劑稀釋抗原，乳化后注射；第2次至第4次免疫使用不完全弗氏佐劑稀釋抗原進(jìn)行免疫；每次免疫間隔2周。
11、優(yōu)選的，s2中第一輪巢式pcr以獲得的cdna為模板，以call001-f和call002-r為引物，call001-f的序列如seq?id?no.1所示，call002-r的序列如seq?id?no.2所示；第二輪巢式pcr以第一輪巢式pcr的膠回收產(chǎn)物為模板，以vhh-f和vhh-r為引物，vhh-f的序列如seqid?no.3所示，vhh-r的序列如seq?id?no.4所示。
12、優(yōu)選的，s2中巢式pcr的體系均為2×taq?master?mix?10μl，10μm上游引物和下游引物各1μl，模板≤200ng，采用無(wú)rnase水補(bǔ)齊至20μl。
13、優(yōu)選的，s2中第一輪巢式pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃?3min；94℃?30s，60℃?30s，72℃60s，循環(huán)30次；72℃?10min；第二輪巢式pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃?3min；94℃?30s，60℃?30s，72℃?30s，循環(huán)30次；72℃?10min。
14、優(yōu)選的，第一輪巢式pcr膠回收700bp左右的重鏈抗體片段，第二輪巢式pcr膠回收大小約400bp的vhh片段。
15、優(yōu)選的，s6中prssv-gp5蛋白的濃度分別為20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml。
16、一種如上所述的高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。
17、因此，本專利技術(shù)提供的一種高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體及其制備方法和應(yīng)用，其具體技術(shù)效果如下：
18、（1）本專利技術(shù)提供的prssv-gp5納米抗體與抗原prssv-gp5的親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性高，平衡離解常數(shù)kd為3.84×10-7m，化學(xué)計(jì)量n為1.13，焓變?chǔ)膆為-389.24kj/mol，熵變?chǔ)膕為-1183.35j/mol·k；
19、（2）本專利技術(shù)提供的prssv-gp5納米抗體nb7與抗原的最適濃度均為5μg/ml，在濃度為0.005μg/ml時(shí)依然與gp5蛋白具有一定的結(jié)合能力；
20、（3）本專利技術(shù)提供的prssv-gp5納米抗體的制備方法，簡(jiǎn)單易操作，可以用于與抗原親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、結(jié)合濃度低的prssv-gp5納米抗體的制備。
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1.一種高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體，其特征在于：所述高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體為Nb7，Nb7的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體的制備方法，其特征在于，步驟如下：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體的制備方法，其特征在于：S1中分別于羊駝背部皮下進(jìn)行免疫；PRSSV-GP5抗原注射量為200μg/次，初次免疫使用完全弗氏佐劑稀釋抗原，乳化后注射；第2次至第4次免疫使用不完全弗氏佐劑稀釋抗原進(jìn)行免疫；每次免疫間隔2周。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體的制備方法，其特征在于：S2中第一輪巢式PCR以獲得的cDNA為模板，以Call001-F和Call002-R為引物，Call001-F的序列如SEQ?ID?NO.1所示，Call002-R的序列如SEQ?ID?NO.2所示；第二輪巢式PCR以第一輪巢式PCR的膠回收產(chǎn)物為模板，以VHH-F和VHH-R為引物，VHH-
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體的制備方法，其特征在于：S2中巢式PCR的體系均為2×Taq?Master?Mix?10μL，10μM上游引物和下游引物各1μL，模板≤200ng，采用無(wú)RNase水補(bǔ)齊至20μL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體的制備方法，其特征在于：S2中第一輪巢式PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃?3min；94℃?30s，60℃?30s，72℃?60s，循環(huán)30次；72℃10min；第二輪巢式PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃?3min；94℃?30s，60℃?30s，72℃?30s，循環(huán)30次；72℃?10min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體的制備方法，其特征在于：第一輪巢式PCR膠回收700bp左右的重鏈抗體片段，第二輪巢式PCR膠回收大小約400bp的VHH片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體的制備方法，其特征在于：S6中PRSSV-GP5蛋白的濃度分別為20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL。
9.一種如權(quán)利要求1所述的高穩(wěn)定性PRSSV-GP5納米抗體在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體，其特征在于：所述高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體為nb7，nb7的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，氨基酸序列如seq?id?no.6所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體的制備方法，其特征在于，步驟如下：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體的制備方法，其特征在于：s1中分別于羊駝背部皮下進(jìn)行免疫；prssv-gp5抗原注射量為200μg/次，初次免疫使用完全弗氏佐劑稀釋抗原，乳化后注射；第2次至第4次免疫使用不完全弗氏佐劑稀釋抗原進(jìn)行免疫；每次免疫間隔2周。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性prssv-gp5納米抗體的制備方法，其特征在于：s2中第一輪巢式pcr以獲得的cdna為模板，以call001-f和call002-r為引物，call001-f的序列如seq?id?no.1所示，call002-r的序列如seq?id?no.2所示；第二輪巢式pcr以第一輪巢式pcr的膠回收產(chǎn)物為模板，以vhh-f和vhh-r為引物，vhh-f的序列如seq?id?no.3所示，vhh-r的序列如seq?id?no.4所示。
5.根...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：薛之霖，姬凱元，張運(yùn)海，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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