【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程，具體涉及一種 sbhr基因缺失的冰城鏈霉菌及其制備方法與應用。
技術介紹
1、南昌霉素，國外稱獵神霉素，是一種主要應用于農業研究的具有抗菌性的物質，具體屬于酸性酯溶性聚醚類抗生素。南昌霉素主要用于抑制革蘭氏陽性菌，有很強的抗球蟲活性，還可以有效地抑制寨卡病毒（zika?virus,?zikv）感染和登革病毒（dengue?virus,denv）感染。
2、冰城鏈霉菌（ streptomyces?bingchenggensis）bc04是米爾貝霉素工業生產菌。在實驗室主產米爾貝霉素的發酵條件下，該冰城鏈霉菌還產生一種聚醚類抗生素：南昌霉素。在鏈霉菌中，抗生素合成是由不同層級的調控因子嚴密調控的，包括簇內調控因子、多效性調控因子以及全局性調控因子。deor家族轉錄調控蛋白廣泛存在于鏈霉菌中。但到目前為止，鏈霉菌中deor調控蛋白的功能及其調控機制研究較少。因此，從冰城鏈霉菌中挖掘新穎影響南昌霉素合成的轉錄因子，并解析相應調控機制，將為構建南昌霉素高產菌提供重要的高產育種基因資源。
技術實現思路
1、為了提高利用冰城鏈霉菌生產南昌霉素的產量，本專利技術通過對冰城鏈霉菌的基因組和轉錄組數據進行分析，發現了一個deor家族轉錄調控基因 sbhr，該調控基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。本專利技術通過在冰城鏈霉菌bc04
2、為解決上述技術問題并實現相應技術效果，本專利技術提供了如下技術方案：
3、本專利技術的第一個目的是提供一種 sbhr基因缺失的冰城鏈霉菌重組菌株，其特征在于，所述冰城鏈霉菌重組菌株是以冰城鏈霉菌（ streptomyces?bingchenggensis）bc04為出發菌株，在出發菌株中敲除 sbhr基因而獲得的；所述 sbhr基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、在本專利技術的一種實施方式中，所述基因缺失是指基因失活，即基因核苷酸序列中的一個或多個堿基點突變、缺失、插入或重排。“失活”包括部分失活和完全失活，是指基因功能部分或全部喪失，不能產生表達其編碼的蛋白質、或蛋白質表達水平降低或消除、或表達的蛋白質的相關生物學活性降低或消失，例如基因不能被轉錄或者轉錄的rna不能被翻譯為具有相應活性的蛋白質、或者產生的蛋白質的量或其活性與未進行所述失活操作的基因翻譯的蛋白質的量或活性相比是降低或者消失的。
5、本領域技術人員應理解，已知的任何適于鏈霉菌中的基因失活方法均可以用于進行本專利技術的基因失活，例如包括但不限于基因替換、基因敲除、插入失活、移碼突變、定點誘變、基因部分缺失、基因沉默、rnai、反義抑制等。對于通過上述方法失活基因可以參見本領域已知的教科書、技術手冊和參考文獻（例如kieser，t.?et?al.practical streptomycesgenetics：a?laboratory?manual.?[j].?2000;?li,?t.?et?al.crispr-cpf1-assisted?multiplex?genome?editing?and?transcriptional?repressionin streptomyces[j].?appl?environ?microbiol,?2018,?84）。
6、在本專利技術的一種實施方式中，所述出發菌株為冰城鏈霉菌bc04。
7、本專利技術的第二個目的是提供上述冰城鏈霉菌重組菌株的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
8、1）目的基因敲除質粒的構建：以質粒psetddcpf1為模板，以rsbhr-f和rsbhr-r為引物，pcr擴增出含有特異性靶向 sbhr基因的sgrna片段，將sgrna片段與載體psetddcpf1連接，得到敲除質粒psetddcpf1/sbhr；
9、2）將步驟1）獲得的敲除質粒psetddcpf1/sbhr導入大腸桿菌，通過屬間接合轉移轉入作為出發菌株的冰城鏈霉菌，獲得 sbhr基因缺失的冰城鏈霉菌。
10、在本專利技術的一種實施方式中，步驟1）所述rsbhr-f和rsbhr-r的核苷酸序列分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
11、在本專利技術的一種實施方式中，所述步驟1）是將sgrna片段與 spei和 ndei雙酶切處理的載體psetddcpf1，通過clonexpress?multis試劑盒組裝獲得敲除質粒。
12、在本專利技術的一種實施方式中，步驟2）所述大腸桿菌為et12567/puz8002。
13、本專利技術的第三個目的是提供上述冰城鏈霉菌重組菌株在生產南昌霉素中的應用，所述應用是將冰城鏈霉菌重組菌株經發酵培養后生產南昌霉素。
14、在本專利技術的一種實施方式中，所述發酵培養是指將冰城鏈霉菌重組菌株依次接種于種子培養基和發酵培養基中進行培養。
15、在本專利技術的一種實施方式中，所述發酵培養基的組成為：黃豆餅粉20?g/l，蔗糖80g/l，脫脂奶粉1?g/l，feso4·7h2o?0.1?g/l，k2hpo41?g/l，caco33?g/l，余量為水，ph為7.0。
16、在本專利技術的一種實施方式中，所述種子培養基的組成為：蔗糖10?g/l，脫脂奶粉1g/l，酵母浸粉5?g/l，細菌蛋白胨3.5?g/l，k2hpo40.5?g/l，余量為水，ph為7.2。
17、本專利技術的有益效果：
18、本專利技術通過對冰城鏈霉菌的全基因組以及轉錄組進行分析，發現了一個轉錄水平（fpkm）大于1000的deor家族轉錄調控因子sbhr，該轉錄調控因子由核苷酸序列如seq?idno.1所示的 sbhr基因編碼。通過在冰城鏈霉菌（ streptomyces?bingchenggensis）bc04中敲除 sbhr基因，構建了 sbhr基本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種sbhR基因缺失的冰城鏈霉菌重組菌株，其特征在于，所述冰城鏈霉菌重組菌株是以冰城鏈霉菌（Streptomyces?bingchenggensis）為出發菌株，在出發菌株中敲除sbhR基因而獲得的；所述sbhR基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.根據權利要求1所述的冰城鏈霉菌重組菌株，其特征在于，所述出發菌株為冰城鏈霉菌BC04。
3.權利要求1或2任一所述冰城鏈霉菌重組菌株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1）所述RsbhR-F和RsbhR-R的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1）是將sgRNA片段與SpeI和NdeI雙酶切處理的載體pSETddCpf1，通過ClonExpress?MultiS試劑盒組裝獲得敲除質粒。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2）所述大腸桿菌為ET12567/pUZ8002。
7.權利要求1或2任
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述發酵培養是指將冰城鏈霉菌重組菌株依次接種于種子培養基和發酵培養基中進行培養。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述發酵培養基的組成為：黃豆餅粉20?g/L，蔗糖80?g/L，脫脂奶粉1?g/L，FeSO4·7H2O?0.1?g/L，K2HPO4?1?g/L，CaCO3?3?g/L，余量為水，pH為7.0。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述種子培養基的組成為：蔗糖10?g/L，脫脂奶粉1?g/L，酵母浸粉5?g/L，細菌蛋白胨3.5?g/L，K2HPO4?0.5?g/L，余量為水，pH為7.2。
...【技術特征摘要】
1.一種sbhr基因缺失的冰城鏈霉菌重組菌株，其特征在于，所述冰城鏈霉菌重組菌株是以冰城鏈霉菌（streptomyces?bingchenggensis）為出發菌株，在出發菌株中敲除sbhr基因而獲得的；所述sbhr基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據權利要求1所述的冰城鏈霉菌重組菌株，其特征在于，所述出發菌株為冰城鏈霉菌bc04。
3.權利要求1或2任一所述冰城鏈霉菌重組菌株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1）所述rsbhr-f和rsbhr-r的核苷酸序列分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1）是將sgrna片段與spei和ndei雙酶切處理的載體psetddcpf1，通過clonexpress?multis試劑盒組裝獲得敲除質粒。
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【專利技術屬性】
技術研發人員：李珊珊，王佳彬，張艷艷，向文勝，
申請(專利權)人：中國農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：
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