抗蟲棉花植物及其鑒定方法技術

本發明專利技術提供特定的轉基因棉花植物、植物材料和種子，其特征在于這些產品在棉花基因組的特定位置包含特定轉化事件。本發明專利技術也提供允許快速和明確鑒定生物樣品中的所述事件的工具。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及轉基因棉花植物，植物材料及種子，其特征在于包含一個 特定的轉化事件，特別是在棉花基因組的特定部位存在編碼可賦予昆蟲抗 性的蛋白的基因。本專利技術的棉花植物組合了昆蟲抗性表型、農學性狀、遺 傳穩定性、以及對不同遺傳背景的適應性(等同于非轉化棉花系在無昆蟲 狀況下)。本專利技術進一步提供了在生物樣品中鑒定特別包含了轉化事件EF-GH5的植物材料的存在的方法和試劑盒。
技術介紹
植物中轉基因的表型表達取決于基因本身的結構，以及其在植物基 因組中的位置。同時，在基因組的不同位置轉基因(外源DNA中)的存 在將以不同的方式影響植物的整體表型。通過遺傳操作，在農學上或工業 上成功地將商業上感興趣的性狀引入到植物中是一個長期的過程，這取決 于不同的因素。轉基因植物的實際轉化和再生僅僅是一 系列選擇步驟的第 一步，選擇步驟包括廣泛的遺傳表征，育種，田間試驗評價，最終實現優 良品系的選擇。棉纖維是全世界最重要的紡織原料。每年全球收獲大約80，000，000英 畝棉花。就面積產量而言，棉花是美國第五大作物，2000年其種植超過了 15,000,000英畝。靠棉花為生的最具破壞性的昆蟲物種有/^//cover/w(玉米果穗 螟蜂或棉鈴蟲)、^Te/icover/m tfr附/gem (美洲棉鈴蟲)、^^//W/r/s v/resce"s (煙 青蟲)及/Te//covcr/7fl戸wc,/gmi。鑒于對新型食品和新型祠料的關注，GMO和非GMO產品的分開，9以及對專利材料的鑒別，優良事件的明確鑒定正變得愈加重要。理想的是， 該鑒定方法既快又簡單，還不需要大量的實驗室設備。此外，該方法應提 供不需專家解釋就能使優良事件明確確定的結果，但是如果必要的話，在 專家伃細審查下，結果被證明有效。本文描述了在生物樣品中鑒定優良事件EF-GH5而用到的特定工具。在開發抗蟲棉(G^5^/"附/^'raW"柳)過程中，從轉基因棉花植物群體中 將EE-GH5鑒定作為優良事件，它包含編碼來自蘇云金芽孢桿菌(丑""7/附 幼W7'fl^e附&)的殺蟲晶體蛋白的基因。轉基因棉花植物包含編碼Bt殺蟲 晶體蛋白(如WO03/093484所述)的嵌合基因，其處于植物可表達啟動子 的控制之下。包含抗蟲基因的棉花植物已經在本領域中公開。但是，并沒有任何現 有技術公開內容教導或提示了本專利技術。專利技術概述本專利技術涉及轉基因棉花植物、或其種子、細胞或組織，其包含穩定整 合在其基因組中的表達盒，該表達盒包含一個包含crylAb基因編碼序列 的抗蟲基因(如本文實施例1.1所述)，其為抗蟲的，在無昆蟲壓力下， 該轉基因植物及其材料具有與非轉基因的等基因系基本上等同的農學性 能。在有昆蟲壓力下，該轉基因植物將具有比非轉基因植物優越的農學表 型。根據本專利技術，棉花植物、或其種子、細胞或組織包含優良事件EE-GH5。 更確切地說，本專利技術涉及轉基因棉花植物、其種子、細胞或組織，其 基因組DNA的特征在于，當用本文所述的PCR鑒定方法分析，使用兩個 分別針對EE-GH5的5，或3'側翼區和外源DNA的引物時，得到特異于 EE-GH5的片段。所述引物可以分別針對SEQ ID No: 1的5，側翼區和外 源DNA內，例如可以分別包含SEQIDNo: 7和SEQ ID No: 8的核苷酸 序列或由其組成，得到100-700 bp的DNA片段，優選大約129 bp。該引 物也可以分別4十對SEQ ID No: 2內的3，側翼區和外源DNA,例如可以分別包含SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 6的核苷酸序列或由其組成，得到 300-700 bp的DNA片段，優選是大約369 bp。包含本專利技術的優良事件的參考種子已經保藏在ATCC，保藏號為 PTA-8171。本專利技術的一個實施方案是，以ATCC保藏號PTA-8171保藏的 包含優良事件EE-GH5的種子，它可以長成對昆蟲(特別是對好^/"1^7 乎或/^//<^&印.)有抗性的棉花植物。ATCC保藏號為PTA-8171的種子 是一個種子庫，其中包含的至少大約95%的轉基因籽粒對于所述轉基因是 純合的，包含本專利技術的優良事件，這些種子可以長成抗蟲植物，因而這些 植物也可以是草銨膦耐受植物。可播種種子，且生長的植物可以用本文所 述的草銨膦處理，從而得到含有本專利技術的優良事件的百分之百耐受草銨膦 的植物。本專利技術進一步涉及由以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的種子長 成的包含本專利技術的優良事件的植物而來的細胞，組織及子代和后代。本發 明進一步涉及通過以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的種子長成的包含本 專利技術的優良事件的棉花植物的繁殖和/或育種可以得到的植物。本專利技術也涉 及包含優良事件EE-GH5的棉花植物。本專利技術進一步涉及鑒定包含優良事件EE-GH5的轉基因植物、或其細 胞或組織的方法，該方法是基于對轉基因植物、細胞或組織中的特征DNA 序列或由該DNA序列編碼的氨基酸的存在進行鑒定。根據本專利技術優選的 實施方案，這樣的特征DNA序列是15bp的序列，優選是20bp，最優選 是30bp或更多，這些序列包含該事件的插入位點，即部分外源DNA和部 分與之相鄰的棉花基因組(5，或3，側翼區)，這使得優良事件可以被特別 鑒定。本專利技術進一步涉及在生物樣品中鑒定優良事件EE-GH5的方法，該方 法基于可以特異識別EE-GH5的5，和/或3，側翼序列的引物或探針。更確切地說，本專利技術涉及包括擴增生物樣品中存在的核酸序列的方法。 該方法使用至少兩個引物進行聚合酶鏈式反應， 一個識別EE-GH5的5， 或3，側翼區，另一個識別外源DNA內的序列，優選得到一個100-500 bp 的DNA片段。該引物可以分別識別EE-GH5的5'側翼區內的序列(SEQ IDNo.l的1-98位的序列，或SEQ ID No.16的1-563位的序列)或EE-GH5 的3，側翼區內的序列(SEQ ID No.2的41-452位的互補序列),以及外源 DNA內的序列(SEQ ID No.l的99-334位的互補序列，或SEQ ID No.2 的l-40位的序列)。識別5'側翼區的引物可以包含SEQ ID No.7或SEQ ID No.17的核苷^列，識別外源DNA內的序列的引物可以包含本文所述的 SEQ ID No.8， SEQ ID No.18或SEQ ID No.19的核苷醋列。識別3，側翼 區的引物可以包含本文所述的SEQ ID No.6的核苷酸序列，識別外源DNA 內的序列的引物可以包含本文所述的SEQIDNo.3的核苷酸序列。本專利技術更特別地涉及鑒定生物樣品中的優良事件EE-GH5的方法，該 方法包括利用分別具有SEQ ID No.3和6的核苷酸序列的兩個引物通過聚 合酶鏈式反應擴增生物樣品中的核,列，得到大約369 bp的DNA片段。目前的優良事件包含一個外源DNA序列，與最初用于轉化程序的 DNA相比，該序列發生了輕微的重排。這一重排對于優良事件EE-GH5 是獨特的。因此，本專利技術還涉及鑒定生物樣品中的優良事件EE-GH5的方 法，該方法包括通過聚合酶鏈式反應得到一個大約262 bp的DNA片段， 所用的引物位于EE-GH5中外本文檔來自技高網...

【技術保護點】
轉基因棉花植物、或其細胞、部分、種子或子代，每個均在其基因組中包含優良事件ＥＥ－ＧＨ５，包含所述事件的參考種子以保藏號ＰＴＡ－８１７１保藏在ＡＴＣＣ。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：L特落林德爾，S莫昂，D佩林克，V哈貝克斯，H范赫克，
申請(專利權)人：拜爾生物科學公司，
類型：發明
國別省市：BE[比利時]