干擾素-β-1a的聚合物綴合物及其使用制造技術

包含與含有聚亞烷基二醇部分的聚合物偶聯的干擾素－β－１ａ的干擾素β多肽，其中干擾素－β－１ａ和聚亞烷基二醇部分的排列使得干擾素－β－１ａ的活性相對于干擾素β的另一種治療性形式（干擾素－β－１ｂ）有所增強，而且展示的活性與非綴合干擾素－β－１ａ相比沒有降低。本發明專利技術的綴合物在治療性以及非治療性（如診斷性）應用中可以有效采用。（*該技術在2019年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
干擾素－β－1α的聚合物綴合物及其使用的制作方法
技術介紹
多肽和蛋白質在特殊疾病的全身性治療中的使用現在已經被醫學實踐所接受。這些物質在治療中的作用非常重要，以至于許多研究活動正致力于通過重組DNA技術大量合成。這些多肽中的許多種是非常有潛力且可特異誘發其生物學作用的內源性分子。限制這些蛋白質性質的物質用于期望應用的主要因素是，當非胃腸給藥時，它們在短時間內由體內消除。這可能是蛋白酶代謝的結果，或者是通過蛋白質消除常規途徑(諸如腎的過濾)而被清除。由于胃中的蛋白水解作用和強酸性，在這些物質到達靶組織前就把它們破壞了，所以施用它們的口服路線甚至更有問題。制藥業對于這些蛋白質施用路線的相關問題是熟知的，而且正在嘗試各種策略解決它們。已經發表了與蛋白質穩定化有關的大量工作。已知將蛋白質與聚合物物質綴合的多種方法，包括使用葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸。據報道，產生的綴合多肽保留了它們的生物學活性和在非胃腸應用用水中的可溶性。干擾素是許多臨床工作和以改進其施用和生物同化為目的的努力所關注的肽家族。干擾素已經在多種臨床疾病狀態中進行了測試。人干擾素β(該家族成員之一)的使用在多發性硬化癥中得到了最好的確認。最近，在歐洲和美國，重組干擾素β的兩種形式獲得了用于此疾病治療的許可。一種形式是干擾素-β-1a(商標AVONEX,mfg.Biogen公司，Cambridge,MA)，此后可互換使用“干擾素-β-1a”或“[FN-β-1a”。另一種形式是干擾素-β-1b(商標BETASERON,Berlex,Richmond,CA)，此后使用“干擾素-β-1b”表示。干擾素-β-1a是使用天然人類基因序列在哺乳動物細胞中生產的，并進行了糖基化；而干擾素-β-1b是使用經修飾人類基因序列(在第17位氨基酸位置經基因工程改造用絲氨酸取代半胱氨酸)在大腸桿菌中生產的，而且未進行糖基化。以前，我們中的一些人直接比較了干擾素-β-1a和干擾素-β-1b在功能性實驗中的相對體外潛力，結果顯示，干擾素-β-1a的比活性比干擾素-β-1b的比活性高大約10倍(Runkel等人，藥物研究(Pharm.Res.)15:641-649,1998)。根據設計用來鑒定這些活性差異的結構基礎的研究，我們確認了，糖基化是產物間影響比活性的唯一的已知結構差異。碳水化合物的影響很大程度上是通過其對結構的穩定化作用而顯現的。碳水化合物的穩定化作用在熱變性實驗和SEC分析中是明顯的。糖基化的缺乏還與聚集的增加和熱變性敏感性的增加有關。用PNG酶F由干擾素-β-1a通過酶方法除去碳水化合物，將引起去糖基化產物的廣泛沉淀。這些研究表明，盡管干擾素-β-1a和干擾素-β-1b之間存在序列保守性，但是它們是不同的生化實體，由此關于干擾素-β-1b已知的許多知識不能應用于干擾素-β-1a，反之亦然。專利技術概述我們利用了糖基化干擾素β相對于非糖基化形式的優勢。具體而言，我們發展了干擾素-β-1a組合物，該組合物相對于干擾素-β-1b具有增高的活性、并具有PEG化蛋白質普遍具有的醫療特性，而且相比于干擾素-β-1a非綴合形式其活性沒有有效損失。因此，如果進行修飾后的產物(聚合物-干擾素-β-1a綴合物)保留了所有或大部分生物學活性，則可能產生下列特性導致半衰期增加和組織分布變化的藥物動力學和藥效動力學變化(如在血管中維持更長時間的能力)、溶液中的穩定性增加、免疫原性降低、保護免受蛋白水解消化和隨后的活性消除。這種制劑是制藥和醫學領域的實質性進步，并將對干擾素具有一些效用的各種疾病(諸如多發性硬化癥、纖維變性、和其它炎癥性或自身免疫疾病、癌癥、肝炎和其它病毒性疾病)的治療作出顯著貢獻。具體而言，在血管中維持更長時間的能力使得干擾素-β-1a能夠用于抑制血管生成并潛在通過血腦屏障。此外，當配制干擾素-β-1a粉劑形式用于隨后的吸入施用時，通過產生聚合物-干擾素-β-1a綴合物得到的熱穩定性是有利的。我們根據干擾素-β-1a的結晶學結構的知識，發展了干擾素-β-1a-聚合物綴合物，其中聚合物在干擾素-β-1a上的連接位點使得綴合物保留了相對于非綴合干擾素-β-1a的全部干擾素-β-1a活性。本專利技術的一個方面是綴合的干擾素-β-1a復合物，其中干擾素-β-1a與將聚亞烷基二醇作為完整部分摻入的聚合物共價鍵合。在一個特定方面，本專利技術涉及包含與聚合物(其包含聚亞烷基二醇部分)偶聯的生理學有活性的干擾素-β-1a的生理學有活性的干擾素-β-1a組合物，其中干擾素-β-1a和聚亞烷基二醇部分的排列使得組合物中的生理學有活性的干擾素-β-1a相對于單獨的干擾素-β-1a(即沒有偶聯聚合物的非綴合形式)具有增強的半衰期。本專利技術的另一方面是包含與聚合物偶聯的生理學有活性的干擾素-β-1a的干擾素-β-1a組合物，其中干擾素-β-1a是融合蛋白，優選免疫球蛋白融合體。在這種復合物中，N末端(與聚合物的綴合位點)和C末端(與Ig部分的融合位點)非常接近，說明聚合物綴合有可能降低融合蛋白的免疫原性。在另一方面，本專利技術涉及包含與聚合物(其包含聚亞烷基二醇部分)偶聯的生理學有活性的干擾素-β-1a的生理學有活性的干擾素-β-1a組合物，其中干擾素-β-1a和聚亞烷基二醇部分的排列使得組合物中的生理學有活性的干擾素-β-1a的活性相對于單獨的干擾素-β-1b(即沒有偶聯聚合物的非綴合形式)增強。本專利技術的另一個實施方案是綴合的干擾素-β-1a蛋白，其中干擾素-β-1a部分進行了突變，從而為突變蛋白提供了相對于干擾素-β-1a非突變形式選擇性地有所增強的抗病毒和/或抗增殖活性。本專利技術的另一個方面涉及包含與生理學相容的聚乙二醇部分共價偶聯的生理學有活性的干擾素-β-1a的穩定的、水溶性的綴合干擾素-β-1a復合物。在這種復合物中，干擾素-β-1a可以與生理學相容的聚乙二醇部分通過不穩定共價鍵在干擾素-β-1a的游離氨基酸基團處共價偶聯，其中不穩定的共價鍵在體內被生化水解作用和/或蛋白水解作用切斷。在另一個方面，本專利技術涉及包含制藥學可接受載體和含有與生理學相容的聚乙二醇偶聯的干擾素β的穩定的水溶性干擾素-β-1a復合物的劑型。在其它方面，諸如上述的共價偶聯干擾素-β-1a組合物可以采用用于診斷或體外應用的干擾素-β-1a，其中干擾素-β-1a是例如用于免疫實驗或其它診斷性或非體內應用的診斷性試劑。在這種非治療性應用中，本專利技術復合物作為穩定的組合物被高度有效采用，其例如可以在相容溶劑或其它基于溶劑的制劑中進行配制，從而提供抗降解能力增強的穩定組合物形式。用無毒聚合物修飾干擾素-β-1a可以提供某些優勢。如果進行修飾后的產物(聚合物-干擾素-β-1a綴合物)保留了所有或大部分生物學活性，則可能產生下列特性導致半衰期增加和組織分布變化的藥物動力學和藥效動力學變化(如在血管中維持更長時間的能力)、溶液中的穩定性增加、免疫原性降低、保護經修飾干擾素-β-1a免受蛋白水解消化和隨后的活性消除；熱穩定性增加，導致用于口服或吸入使用的粉狀干擾素-β-1a制劑更有效。賦予了上述改進特性的干擾素-β-1a可以在口服、氣霧劑、或非胃腸施用后有效地發揮治療作用。其它施用途徑，諸如鼻腔和經皮給藥，也可能使用本文檔來自技高網...

【技術保護點】
包含與非天然聚合物偶聯的糖基化干擾素β的組合物，該聚合物包含聚亞烷基二醇部分。

【技術特征摘要】
US 1998-10-16 60/104,572;US 1999-2-16 60/120,1611．包含與非天然聚合物偶聯的糖基化干擾素β的組合物，該聚合物包含聚亞烷基二醇部分。2．權利要求1的組合物，其中聚亞烷基部分通過選自下述的基團與干擾素β偶聯醛基、馬來酰亞胺基、乙烯砜基、鹵代醋酸酯基、多個組氨酸殘基、肼基和氨基巰基。3．權利要求1的組合物，其中糖基化干擾素β是干擾素-β-1a，而且在抗病毒實驗中測量時比干擾素-β-1b更有活性。4．權利要求3的組合物，其中干擾素-β-1a由抗病毒實驗測得保留了缺乏所述聚合物的干擾素-β-1a的效力的0.5至1倍。5．權利要求1的組合物，其中干擾素β是干擾素-β-1a融合蛋白。6．權利要求5的組合物，其中干擾素-β-1a融合蛋白包含免疫球蛋白分子一部分。7．權利要求1或5的組合物，其中干擾素β是具有至少下列一項特性的突變型干擾素β:(a)突變型具有比野生型干擾素-β-1a更高的抗病毒活性，其中抗病毒活性是通過病毒誘導的細胞溶解進行測量的；(b)相對于野生型干擾素-β-1a，突變型的抗病毒活性高于抗增殖活性；(c)突變型可結合干擾素受體，但是與野生型干擾素-β-1a相比，其抗病毒活性和抗增殖活性相對低于其受體結合活性。8．包含與含有聚亞烷基二醇部分的聚合物偶聯的生理學有活性的干擾素-β-1a的生理學有活性的干擾素β組合物，其中生理學有活性的干擾素-β-1a和聚亞烷基二醇部分的排列使得，生理學有活性的干擾素β組合物中的生理學有活性的干擾素-β-1a在抗病毒實驗中測量時，相對于生理學有活性的干擾素-β-1b具有增強的活性。9．權利要求8的組合物，其中干擾素-β-1a與聚合物在干擾素-β-1a上的N末端位點偶聯。10．權利要求8的組合物，其中干擾素-β-1a與聚合物在干擾素-β-1a上的C末端或附近位點偶聯。11．權利要求8的組合物，其中干擾素-β-1a與聚合物在某個位點通過干擾素-β-1a上的聚糖部分偶聯。12．權利要求8的組合物，其中干擾素-β-1a是干擾素-β-1a融合蛋白。13．權利要求12的組合物，其中干擾素-β-1a融合蛋白包含免疫球蛋白分子一部分。14．權利要求8或12的組合物，其中干擾素-β-1a是具有至少一項下列特性的突變型干擾素-β-1a:(a)突變型具有比野生型干擾素-β-1a更高的抗病毒活性，其中抗病毒活性是通過病毒誘導的細胞溶解進行測量的；(b)相對于野生型干擾素-β-1a，突變型的抗病毒活性高于抗增殖活性；(c)突變型可結合干擾素受體，但是與野生型干擾素-β-1a相比，其抗病毒活性和抗增殖活性相對低于其受體結合活性。15．包含與含有聚亞烷基二醇部分的聚合物以N末端偶聯的生理學有活性的糖基化干擾素β的生理學有活性的干擾素β組合物，其中生理學有活性的干擾素β和聚亞烷基二醇部分的排列使得，生理學有活性的干擾素β組合物中的生理學有活性的干擾素β在抗病毒實驗中測量時相對于缺乏所述部分的生理學有活性的干擾素β具有基本上相似的活性。16．權利要求15的組合物，其中干擾素β與聚合物在干擾素β上的N末端位點偶聯。17．權利要求15的組合物，其中干擾素β與聚合物在干擾素β上的C末端或附近位點偶聯。18．權利要求15的組合物，其中干擾素β與聚合物在某個位點通過干擾素β上的聚糖部分偶聯。19．權利要求15的組合物，其中干擾素β是干擾素β融合蛋白。20．權利要求19的組合物，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：B佩賓斯基，L蘭科爾，M布里科爾麥爾，A維蒂，P霍奇曼，
申請(專利權)人：拜奧根IDEC馬薩諸塞公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]