多元醇干擾素β偶聯(lián)物制造技術(shù)

用硫醇反應(yīng)ＰＥＧ化劑通過位點特異性ＰＥＧ化過程產(chǎn)生了ＰＥＧ－ＩＦＮ－β偶聯(lián)物（其中一個ＰＥＧ分子和人ＩＦＮ—β的Ｃｙｓ＃＋［１７］共價結(jié)合）。還提供了用于治療感染、腫瘤和自身免疫及炎癥疾病的藥物組合物和方法。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及ＰＥＧ分子連續(xù)分步結(jié)合到多肽，更具體為ＩＦＮ—β上的方法。（*該技術(shù)在2019年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及多元醇-IFN-β偶聯(lián)物，其中多元醇單元和Cys17共價結(jié)合。本專利技術(shù)的另一個目的是其位點特異性產(chǎn)生的過程以及其在細(xì)菌感染、病毒感染、自身免疫疾病和炎癥疾病中治療、預(yù)后或診斷中的用途。本專利技術(shù)還涉及兩個或多個PEG分子分步結(jié)合到多肽上的方法。
技術(shù)介紹
人成纖維細(xì)胞干擾素(IFN-β)具有抗病毒活性而且也能刺激針對致瘤性細(xì)胞的自然殺傷細(xì)胞。它是由病毒和雙鏈RNA誘導(dǎo)的約20,000Da的多肽。Derynk等(自然，285:542-547,1980)用重組DNA技術(shù)克隆的成纖維細(xì)胞基因的核苷酸序列推出了該蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列。它長166個氨基酸。Shepard等(自然，294:536-565,1981)描述了842位的堿基突變能消除其抗病毒活性(位點141Cys→Tyr)，以及具有1119-1121核苷酸缺失的變異克隆。Mark等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81(18):5662-5666,1984)通過用(A)置換469(T)堿基，導(dǎo)致在位點17從Cys→Ser的氨基酸轉(zhuǎn)變，插入了一個人工突變。報道了得到的IFN-β與“天然”IFN-β活性相同，并且在長期儲藏(-70℃)中保持穩(wěn)定。將親水性多聚物聚乙二醇(PEG)(也稱作聚環(huán)氧乙烷)與分子共價結(jié)合是生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)上的重要應(yīng)用。PEG在其最常見形式下是在各末端具有羥基基團(tuán)的線性多聚物HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH該分子式能簡單的代表為HO-PEG-OH，其中指-PEG-代表沒有末端基團(tuán)的多聚物主鏈“-PEG-”指“-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-PEG通常用作甲氧基-PEG-OH，其中一個末端是相對惰性的甲氧基基團(tuán)，而另一個末端是要化學(xué)修飾的羥基基團(tuán)。CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH也常用支鏈PEG。支鏈PEG可以表示成R(-PEG-OH)m，其中R代表例如季戊二醇或丙三醇的中央核心分子，而m代表支化臂的數(shù)目。支化臂的數(shù)目(m)能從三變化到100或更多。羥基基團(tuán)要進(jìn)行化學(xué)修飾。其它如PCT專利申請WO 96/21469所述的支鏈形式具有要進(jìn)行化學(xué)修飾的單個末端。這種PEG類型能表示成(CH3O-PEG-)pR-X，其中p等于2或3，R代表例如賴氨酸或丙三醇的中央核心，而X代表如能進(jìn)行化學(xué)活化的羧基的功能性基團(tuán)。而另一個支鏈形式，“側(cè)基PEG”具有如羧基(其主要在PEG主鏈上而不是在PEG鏈末端)的反應(yīng)性基團(tuán)。除了PEG的這些形式，也能用在主鏈中的弱鍵或可降解鍵來制備多聚物。例如，Harris已在美國專利申請06/026,716中顯示能用多聚物主鏈中可進(jìn)行水解的酯鍵來制備PEG。該水解(反應(yīng))導(dǎo)致多聚物被切成較小分子量的片段，根據(jù)反應(yīng)流程根據(jù)本專利技術(shù)，術(shù)語聚乙二醇或PEG指包括所有上述衍生物。環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共多聚物在其化學(xué)上和PEG密切相關(guān)，而且它們能用來代替PEG的許多應(yīng)用。它們具有以下通式HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH其中R是H或CH3。PEG是具有高水溶性以及在許多有機(jī)溶劑中具有高溶解性的性質(zhì)的有用的多聚物。PEG無毒性也無免疫原性。當(dāng)PEG和水不溶性化合物化學(xué)結(jié)合(PEG化)時，得到的偶聯(lián)物通常是水溶性的，以及在許多有機(jī)溶劑中是可溶的。現(xiàn)在，PEG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物被用于蛋白質(zhì)替代治療和其它治療性用途中。例如，PEG化腺苷脫氨酶(ADAGEN)正將用于治療重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCIDS)，PEG化L-天冬酰胺酶(ONCAPSPAR)正將用于治療急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)，而PEG化干擾素-α(INTRON(R)A)正在進(jìn)行治療丙型肝炎的三期試驗。對于具有臨床功效的PEG蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的綜述，可見N.L.Burnham,Am.J.Hosp.Pharm.,15:210-218,1994。已經(jīng)開發(fā)了得到PEG化蛋白質(zhì)的不同方法。將PEG與蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)性基團(tuán)結(jié)合通常是利用親電活化PEG衍生物完成的。將PEG與賴氨酸殘基和N末端上找到的α-和ε-氨基基團(tuán)結(jié)合，得到組成產(chǎn)物混合物的偶聯(lián)物。通常，這些偶聯(lián)物包括每個蛋白質(zhì)分子結(jié)合的PEG分子數(shù)從0到蛋白質(zhì)中氨基基團(tuán)數(shù)變化的偶聯(lián)物。對于已經(jīng)單獨修飾的蛋白質(zhì)分子，PEG單元可以結(jié)合在許多不同的胺位點上。非特異性PE固化的這種類型已經(jīng)產(chǎn)生了許多變得幾乎無活性的偶聯(lián)物。活性減弱通常是由于如同在許多細(xì)胞因子和抗體中一樣，屏蔽了蛋白質(zhì)的活性結(jié)合功能域所致。例如，Katre等在美國專利4,766,106和美國專利4,917,888中描述了用超量許多的甲氧基-聚乙二醇基N-琥珀酰亞胺基戊二酸和甲氧基-聚乙二醇基N-琥珀酰亞胺基琥珀酸PEG化IFN-β和IL-2。兩種蛋白質(zhì)都是在微生物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的，其允許自由半胱氨酸位點特異性突變?yōu)榻z氨酸。突變在IFN-β的微生物表達(dá)中是必需的，以促進(jìn)蛋白折疊。具體的，這些實驗中所用的IFN-β是商業(yè)產(chǎn)品Betaseron，其中Cys17被絲氨酸替換。另外，無糖基化減弱了它在水溶液中的可溶性。非特異性PEG化導(dǎo)致可溶性提高，但主要問題是活性和產(chǎn)量的水平降低。歐洲專利申請EP 593 868(題為PEG-干擾素結(jié)合物)，描述了PEG-IFN-α的制備。然而，PEG化反應(yīng)不是位點特異性的，并因此獲得了PEG-IFNα偶聯(lián)物位置異構(gòu)體的混合物(也見Monkarsh等，ACS.Symp.Ser.,680:207-216,1997)。Kinstler等在歐洲專利申請EP 675 201中演示了用mPEG-丙醛對巨核細(xì)胞生長和發(fā)育因子(MGDF)的N-末端殘基的選擇性修飾。這考慮到批間可重復(fù)性PEG化和藥物代謝動力學(xué)。Gilbert等在美國專利5,711,944中證明能產(chǎn)生具有最適水平活性的IFN-α的PEG化。在該例中需要費力的純化步驟來獲得最適偶聯(lián)物。大部分細(xì)胞因子，以及其它蛋白質(zhì)沒有特異性PEG結(jié)合位點，而且除上文提到的例子以外，很可能一些通過PEG化反應(yīng)產(chǎn)生的異構(gòu)體部分或完全無活性，從而導(dǎo)致最終混合物的活性喪失。因此位點特異性單-PEG化是這些蛋白質(zhì)偶聯(lián)物制備中的理想目標(biāo)。Woghiren等在Biocon.jugate Chem.,4(5):314-318,1993中為這樣的位點特異性PEG化合成了硫醇選擇性PEG衍生物。顯示了穩(wěn)定的硫醇保護(hù)的PEG衍生物以二硫正吡啶反應(yīng)基團(tuán)的形式與蛋白質(zhì)木瓜蛋白酶的自由半胱氨酸特異性偶聯(lián)。木瓜蛋白酶和PEG酯鍵新形成的二硫鍵能在溫和降解條件下被切開，以再生天然蛋白。本文任何文件的引用并不承認(rèn)這些文件是有關(guān)現(xiàn)有技術(shù)，或是本申請任何權(quán)利要求專利性的材料。任何對任一文件的內(nèi)容和時間的陳述是基于在提交時對申請人可得的信息，不是對該陳述正確性的承認(rèn)。專利技術(shù)簡述在本專利技術(shù)中提供了多元醇-IFN-β偶聯(lián)物，具體是PEG-IFN-β偶聯(lián)物，其中多元醇單元與Cys17共價結(jié)合。通過使硫醇反應(yīng)性多元醇劑和IFN-β中的Cys17殘基反應(yīng)獲得特異性偶聯(lián)物。希望這種偶聯(lián)物在體內(nèi)顯示提高的作用。目標(biāo)是獲得在中等pH可溶性提高，穩(wěn)定性提高(減少聚集)，免疫原性減弱，以及與“天然”IFN-β比較不損失活性。這種聚合反應(yīng)的結(jié)果將減少達(dá)到所需效果本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種多元醇－干擾素－β偶聯(lián)物，其特征在于，該偶聯(lián)物具有與人干擾素－β的Ｃｙｓ↑［１７］共價結(jié)合的多元醇分子。

【技術(shù)特征摘要】
US 1998-4-28 60/083,3391．一種多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物，其特征在于，該偶聯(lián)物具有與人干擾素-β的Cys17共價結(jié)合的多元醇分子。2．如權(quán)利要求1所述的多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物，其特征在于，所述多元醇分子是聚亞烷基二醇分子。3．如權(quán)利要求2所述的多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物，其特征在于，所述聚亞烷基二醇分子是聚乙二醇分子。4．如權(quán)利要求1-3任一所述的多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物，其特征在于，多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物具有和天然人干擾素-β相同或更高的干擾素-β活性。5．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物的方法，其特征在于，該過程包括以下步驟用硫醇反應(yīng)性多元醇劑和干擾素-β反應(yīng)，來使多元醇分子和人干擾素-β位點特異性共價結(jié)合，從而產(chǎn)生多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物；以及回收產(chǎn)生的多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物。6．如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述硫醇反應(yīng)性多元醇是硫醇反應(yīng)性PEG化劑。7．如權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反應(yīng)性多元醇劑是單甲氧基化的。8．如權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反應(yīng)性多元醇劑是雙功能性的。9．如權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反應(yīng)性多元醇劑是具有選自二硫正吡啶、乙烯砜、馬來酰亞胺和碘乙酰胺的官能團(tuán)的多元醇衍生物。10．如權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反應(yīng)性多元醇劑是單甲氧基化多元醇的二硫正吡啶衍生物。11．如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該反應(yīng)步驟在干擾素-β穩(wěn)定的酸性pH下進(jìn)行。12．一種藥物組合物，其特征在于，該組合物包括作為活性成分的、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的多元醇-干擾素-β偶聯(lián)物，和藥物學(xué)可接受的載體、賦形劑或輔助劑。13．一種治療感染、腫瘤和自身免疫及炎癥疾病的方法，其特征在于，該方法包括對需要治療的病人施用有效量的權(quán)利要求12所述的藥物組合物。14．一種分步連續(xù)將聚乙二醇和多肽結(jié)合的方法，其特征在于，該方法包括步驟將多肽和低分子量異雙功能性或同雙功能性聚乙二醇分子反應(yīng)，所述聚乙二醇分子具有下列分子式W-CH2CH2O(C...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：N埃爾塔亞，MJ羅伯茨，M哈里斯，W索利維切，
申請(專利權(quán))人：應(yīng)用研究系統(tǒng)ARS股份公司，
類型：發(fā)明
國別省市：AN[菏屬安的列斯群島]