心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ診斷試劑制造技術

一種急性心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ診斷試劑，主要包括人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ基因在大腸桿菌中的高表達產物作為陽性對照及該表達產物作為抗原制備的單抗和多抗。診斷方法為雙抗體夾心法，即以固相化的單抗捕獲檢測血清中的抗原－心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ，用多抗作為檢測抗體，根據酶與底物反應后所測得的ＥＬＩＳＡ讀數值與本發明專利技術提供的臨界值（ｃｕｔ ｏｆｆ值）比例，大于ｃｕｔ ｏｆｆ值的，判斷為急性心肌梗塞發病期。（*該技術在2018年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及人心臟疾病的診斷試劑，尤其是關于人急性心肌梗塞、心肌炎的新的臨床診斷試劑。心血管疾病是我國主要的疾病之一，特別是隨著我國居民老齡化程度的增加，急性心肌梗塞的死亡率逐年上升，心肌炎病例也大為增加。目前，雖然急性心肌梗塞的血液檢測已有臨床廣泛使用的磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)以及谷草轉氨酶(GOT)等方法，但其早期性、靈敏性和持久性均不能滿足臨床要求，只能在患者發病后二、三天內適用，致使患者發生猝死的現象時有發生。心肌梗塞在國內發病率很高，特別是我國北方地區大大高于南方，達十倍以上。目前，由于全球老齡化程度的增加帶來了心血管疾病發生率的提高，這也為檢測試劑的應用提供了廣闊的市場。因此一種更加靈敏、專一，早期、持久的心肌梗塞檢測試劑的研制，成為國內外心臟疾病防治和治療的迫切需要。肌球蛋白是肌肉中的一種主要的結構蛋白，在肌肉收縮中起重要作用，由一條重鏈及二條分子量分別為27KD和20KD的輕鏈(輕鏈Ⅰ和輕鏈Ⅱ)組成。研究發現，由于輕鏈在酸性環境中，易從重鏈上解離。八十年代初，日本科學家首先發現，當缺血，缺氧引起心肌損害時，心肌組織不斷地長時間地向血液中游離出心肌肌球蛋白輕鏈，而且其時相性的變化可直接反映心肌的破壞過程，由于人心肌輕鏈Ⅰ在血中更穩定，因此可作為檢測心臟疾病的一項新的和重要的生化指標(Yamada T.et al.,Am Heart J 1998 Feb；135(2 Pt 1):329-34；Hisatomi K.et al.,Thorac Cardiovasc Surg 1996 Dec；44(6):296-9；Ravkilde J.et al.,J Am Coll Cardiol 1995 Mar1；25(3):574-81；Ravkilde J.et al.,Cardiology 1994；84(2):135-44；Uchino T.et al.,J Cardiovasc Surg 1993,Dec；34(6):517-22)。自上述理論建立以來，歐、美和日本的不少實驗室嘗試將人心肌肌球蛋白輕鏈的抗體結合放射免疫方法應用到人心肌梗塞病例的測定上，獲得了滿意的結果。然而，國外至今僅有實驗室內小規模應用的報導，尚未見正式生產的診斷試劑盒，究其原因主要是1)肌球蛋白具有相當特殊的性質，要從心肌中分離出足夠量的肌球蛋白并進行輕、重鏈的拆分，必須具備扎實的肌肉蛋白研究的理論基礎；2)作為臨床診斷試劑盒，必須有人心肌肌球蛋白輕鏈作為抗原對照，其來源受到很大的限制。為此，本專利技術的目的是提供一種心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ診斷試劑，該診斷試劑的應用在早期性、持續性和專一性方面均大大優于目前使用的檢測方法。本專利技術提供的心肌梗塞血液心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ(HCMLCⅠ)診斷試劑，主要包括人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ基因在大腸桿菌中的高表達產物作為陽性對照及該表達產物作為抗原制備的單抗和多抗。單抗的運用，大大提高了診斷試劑的專一性；以ELISA測定方法取代放射免疫法，使之既具有較高的靈敏度又不產生污染，檢測手段方便易行。本專利技術采用雙抗體夾心ELISA法為診斷方法，以固相化的單抗捕獲檢測血清中的抗原--心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ，單抗制備所用的抗原為人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的基因工程表達產物，用辣根過氧化物酶標記的抗心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ作為檢測抗體，根據酶與底物反應后顏色的變化測定血清中的抗原的含量，最終根據ELISA讀數值與本專利技術提供的臨界值(cut off值)比較，大于cut off值的，判斷為急性心肌梗塞的發病期。下面以中國人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ為例分五部分詳述本專利技術的內容。一．中國人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的基因克隆和序列測定1．人心肌總RNA的制備手術后的人心肌，去除其它組織，取心室肌為實驗材料，加預冷的抽提緩沖液，用組織搗碎機勻漿，離心后所得上清用苯酚∶氯仿∶異戊醇混合液抽提直至變性蛋白層消失。水相加無水乙醇后獲得沉淀即為總RNA。2．人心肌總mRNA的制備抽提的總RNA用高效0ligo(dT)纖維素充分混合(振蕩)后置0℃冰箱保溫3-4小時或過夜，取出后再輕微攪拌或振蕩混合，離心后沉淀用含KCl的Tris洗脫后收集上清液，加無水乙醇后獲得沉淀為人心肌總mRNA。3．人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的cDNA構建根據加拿大G.Jackowski 1988年發表的人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的基因順序(G.Jackowski,Nucleic Acid Research,1988)，設計合成與人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的基因3’端和5’端相應的兩個引物(5’GGAATTCCTTAGCTGGACATGATGT 3’和5’GGAATTCCATGGCCCCCAAAAAGCC3’)，并在引物合成的同時接上限制性內切酶EcoRI的接頭。抽提的總mRNA經AMV逆轉錄酶反轉錄酚抽，乙醇沉淀得到cDNA。4．cDNA的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和克隆cDNA的PCR擴增用上述兩引物進行(參見分子克隆操作指南，T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,1989),PCR產物(圖1)經限制性內切酶EcoRⅠ水解后，將其克隆進載體puc19的EcoRⅠ位點，以待測序。5．人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的基因序列測定用標準的“雙脫氧法”測定順序按T.Maniatis的分子克隆操作指南進行操作，其結果如圖2所示，共含有588個堿基，從基因序列推出的HVMLCⅠ的氨基酸序列共含有195個氨基酸。但與加拿大G.Jackowski發表的人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的基因順序相比，有兩處差異，一處是在第24位，由谷氨酸變成丙氨酸，另一處差異更大，即從98位起至101位氨基酸由-天冬酰胺-精氨酸-絲氨酸-賴氨酸變為-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸-谷氨酰胺。(見圖3)為了證明這兩處差異并非由于多聚酶鏈式反應中合成誤差所造成，本專利技術從總mRNA抽提開始共重復實驗兩次，并取用不同的心臟材料，結果完全重復。由此證明中國人HVMLC1的基因具有特征性的序列片段，兩者的差異預計與人種的差異有關。二．人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的表達和表達產物的純化1．表達質粒的構建和克隆用EcoRⅠ將其克隆進載體puc19的PCR產物水解下來，再克隆進表達載體pGEX-3X的EcoRⅠ位點構建成表達質粒。2．表達產物的誘導純化含表達質粒的單菌落在LB(+Amp)中連續培養后，加IPTG進行誘導，37℃培養過夜。離心收集菌體，沉淀懸浮MTPBS緩沖液，超聲波破菌。破菌后離心以去除細胞碎片，上清加Triton X-100離心后再取上清上樣于Glutathione Sepharose 4B柱，上樣后先用PBS緩沖液洗10個柱體積，再用Glutathion洗脫，便得到純化的人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的GST融合表達產物(圖4)。三．人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ表達產物的單克隆抗體制備1．動物免疫取雌性小鼠，用純化的人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的GST融合表達產物加等體積的完全佐劑對小鼠進行腹腔初次免疫；三周后用同樣量的抗原加等體積的非完全佐劑對小鼠進行腹腔第二次免疫；再過二周后用第二次免疫的量對小鼠進行腹腔第三次免疫。融合前三天對已免疫的小鼠用抗原，不加任何佐劑，直接注入脾臟。2．融合骨髓瘤細胞p3x63Ag8·6本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ診斷試劑，其特征在于該診斷試劑主要包括人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ基因在大腸桿菌中的高表達產物作為陽性對照及該表達產物作為抗原制備的單抗和多抗。

【技術特征摘要】
1.一種心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ診斷試劑，其特征在于該診斷試劑主要包括人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ基因在大腸桿菌中的高表達產物作為陽性對照及該表達產物作為抗原制備的單抗和多抗。2.如權利要求1所述的診斷試劑，其特征在于所述的人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ基因是中國人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ基因。3.如權利要求2所述的診斷試劑，其特征在于所述的中國人心肌肌球蛋白輕鏈Ⅰ的基因序列和氨基酸序列如下ATG GCC CCC AAA AAG CCA GAG CCC AAG AAG GAT GAT GCC AAG GCA GCC CCC AAG GCA GCT 60CCA GCT CCC GCA CCT CCC CCT GAG CCT GAG CGC CCT AAG GAG GTC GAG TTT GAT GCT TCC 120AAG ATC AAG ATT GAG TTC ACA CCT GAG CAG ATT GAA GAG TTC AAG GAA GCC TTC ATG CTG 180TTC GAC CGC ACA CCC AAG TGT GAG ATG AAG ATC ACC TAC GGG CAG TGT GGG GAT GTC CTG 240CGG GCG CTG GGC CAG AAC CCC ACA CAG GCA GAA GTG CTC CGT GTC CTG GGG AAG CCA AGA 300CAG GAA GAG CTC AAT ACC AAG ATG ATG GAC TTT GAA ACT TTC CTG CCT ATG CTC CAG CAC 360ATT TCC AAG AAC AAG GAC ACA GGC ACC TAT GAG GAC TTC GTG GAG GGG CTG CGG GTC TTC 420GAC AAG GAG GGC AAT GGC ACT GTC ATG GGT GCT GAG CTT CGC CAC GTG CTG GCC ACG CTG 480GGT GAG AGG CTG ACA GAA GAC GAA GTG GAG AGG TTG ATG GCT GGG CAA GAG GAC TCC AAT ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：龔祖塤，彭寶珍，周國瑛，黃人健，曹慧婷，沈學仁，沈菊英，吳建華，
申請(專利權)人：中國科學院上海生物化學研究所，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]