造血前體細(xì)胞保護(hù)劑制造技術(shù)

一種以凝血酶致敏蛋白（ＴＳＰ）或其活性片段為有效成分的造血前體細(xì)胞保護(hù)劑。可作為治療抗腫瘤藥物誘發(fā)的血細(xì)胞減少癥。單獨(dú)地使用或與細(xì)胞生長(zhǎng)因子合用，能體外或ＥＸ ＶＩＶＯ擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。（*該技術(shù)在2015年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
?造血前體細(xì)胞保護(hù)劑本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種造血前體細(xì)胞保護(hù)劑及其用途。更具體地說(shuō)，涉及一種以凝血酶致敏蛋白(Thrombospondin，簡(jiǎn)稱(chēng)TSP)或其活性片段為有效成分的造血前體細(xì)胞保護(hù)劑及其在治療抗腫瘤藥物誘發(fā)的血細(xì)胞減少癥和擴(kuò)增造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞中的應(yīng)用。現(xiàn)在最常用的治療腫瘤的方法是化學(xué)療法，即，使用一些抗腫瘤藥物將異常增殖的腫瘤細(xì)胞殺死。由于抗腫瘤藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞特別是骨髓造血細(xì)胞也有殺傷作用，造成血細(xì)胞減少，而白細(xì)胞減少會(huì)使機(jī)體抵御外來(lái)感染的能力降低，紅細(xì)胞減少會(huì)造成貧血，血小板減少則可導(dǎo)致機(jī)體出血。目前治療化學(xué)療法導(dǎo)致的血細(xì)胞減少的主要方法包括輸血和輸血液成份、使用能促使血細(xì)胞增殖的因子如G-CSF、GM-CSF、EPO和TPO等。已知造血多能干細(xì)胞在一定的條件下能向粒單細(xì)胞、紅細(xì)胞或巨核細(xì)胞的祖細(xì)胞分化，進(jìn)一步增殖產(chǎn)生成熟的白細(xì)胞、紅細(xì)胞或巨核細(xì)胞，每個(gè)巨核細(xì)胞又能產(chǎn)生數(shù)千個(gè)有功能的血小板。造血細(xì)胞的增殖和分化受許多因子的調(diào)節(jié)，這些因子包括白細(xì)胞介素3、6、11、13和SCF、GM-CSF、TPO、MPO以及EPO。它們單獨(dú)使用或合用能刺激一個(gè)系列或多個(gè)系列造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。在正常情況下，造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞主要存在于骨髓中，新生兒臍帶血和胚胎肝臟中含量也較豐富，人末梢血中含量較低。骨髓、臍帶血、胚胎肝臟以及末梢血都可用作造血干細(xì)胞的來(lái)源，但上述來(lái)源十分有限，而且，骨髓、臍帶血和末梢血中可采集的造血干祖細(xì)胞絕對(duì)數(shù)較低，不能滿(mǎn)足移植的需要。-->已知TSP是血小板α顆粒的主要成份之一，在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞中也有合成。TSP在細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用中起重要作用，還能促使包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞粘附到基質(zhì)上。此外，TSP還有抗血管形成作用。TSP是由同源三聚體構(gòu)成的糖蛋白，分子量450Kd，含有幾個(gè)功能區(qū)域，其中最令人注意的是能與肝素結(jié)合的區(qū)域，這些區(qū)域能促使TSP結(jié)合在細(xì)胞表面的硫酸肝素糖聚蛋白(proteoglycans)上，有調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種造血前體細(xì)胞保護(hù)劑及使用該保護(hù)劑治療抗腫瘤藥物誘發(fā)的血細(xì)胞減少癥以及體外擴(kuò)增造血前體細(xì)胞的方法。本專(zhuān)利技術(shù)所述的造血前體細(xì)胞保護(hù)劑是以凝血酶致敏蛋白(TSP)和/或其活性片段作為有效成分的。上述凝血酶致敏蛋白及其活性片段可以是天然的、基因重組的或它們的混合物。凝血酶致敏蛋白的活性片段的具體例子包括由凝血酶致敏蛋白N末端的第1至第174個(gè)氨基酸殘基組成的片段，簡(jiǎn)稱(chēng)TSP1-174。上述造血前體細(xì)胞是指造血多能干細(xì)胞(stem?cell)和各系列定向祖細(xì)胞(progenitor?cells)，包括HPP-CFC(高增殖潛能集落形成細(xì)胞)、CFU-Mix或CFU-GEMM(混合集落形成單位)、CFU-MK(巨核細(xì)胞集落形成單位)、CFU-GM(粒單細(xì)胞集落形成單位)、BFU-E(紅細(xì)胞集落形成單位)等，其來(lái)源包括人臍帶血、骨髓、末梢血和胚肝。本專(zhuān)利技術(shù)是以下述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的：觀察到TSP和其含肝素結(jié)合區(qū)域的片段TSP1-174對(duì)造血多能干細(xì)胞(HPP-CFC和CFU-GEMM)和巨核細(xì)胞祖細(xì)胞(CFU-MK)生長(zhǎng)有抑制作用，這種抑制作用是可逆性的，用TSP或其活性片段作用過(guò)的造血前體細(xì)胞經(jīng)洗滌后，可-->在新的細(xì)胞培養(yǎng)液中增殖分化。另外，TSP及其活性片段的抑制作用能完全被肝素中和。利用TSP及其活性片段對(duì)造血前體細(xì)胞有可逆性作用這一特點(diǎn)，本專(zhuān)利技術(shù)者設(shè)想以TSP或其活性片段作為造血前體細(xì)胞保護(hù)劑預(yù)處理造血前體細(xì)胞，使處理后的細(xì)胞因其增殖一時(shí)性受抑，對(duì)隨后加入的抗腫瘤藥物的敏感性降低，從而不被抗腫瘤藥物殺死。由此設(shè)計(jì)的一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全證實(shí)了TSP和其活性片段能降低造血干、祖細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，保護(hù)它們免受抗腫瘤藥物的殺傷。在本專(zhuān)利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，將TSP先注射入小鼠體內(nèi)，然后再注射抗腫瘤藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)先注射過(guò)TSP的小鼠，其造血功能的恢復(fù)較對(duì)照組小鼠快。這些體內(nèi)結(jié)果與上述體外結(jié)果相符合，表明TSP確實(shí)對(duì)骨髓造血前體細(xì)胞有保護(hù)作用，可預(yù)防或緩解化學(xué)療法誘發(fā)的骨髓衰竭和血細(xì)胞減少癥。在治療由抗腫瘤藥物誘發(fā)的血細(xì)胞減少癥時(shí)，本專(zhuān)利技術(shù)的造血前體細(xì)胞保護(hù)劑除可單獨(dú)使用外，還可以與其它能促進(jìn)血細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物合用，產(chǎn)生相加或協(xié)同作用。所述促進(jìn)血細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物也即造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子的例子包括白細(xì)胞介素3(IL3)、白細(xì)胞介素6(IL6)、白細(xì)胞介素11(IL11)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒單細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(c-Mpl?Ligand)、巨核細(xì)胞生成素(MPO)以及粘多糖等。在本專(zhuān)利技術(shù)的另一實(shí)施例中，先注射TSP到小鼠體內(nèi)，然后注射抗腫瘤藥物，最后再注射細(xì)胞生長(zhǎng)因子G-CSF。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合用TSP和生長(zhǎng)因子，其加速化療后造血功能恢復(fù)的作用優(yōu)于TSP或生長(zhǎng)因子的單獨(dú)使用。將TSP單獨(dú)地或與上述造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合使用，能在體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，特別是巨核細(xì)胞及其祖細(xì)胞。其基本方法是：將骨髓或臍帶血細(xì)胞和作為營(yíng)養(yǎng)源的供體血清與TSP單獨(dú)地或-->加生長(zhǎng)因子共孵育若干時(shí)間，或先經(jīng)生長(zhǎng)因子孵育，后加入TSP再孵育若干時(shí)間，促使早期干細(xì)胞向祖細(xì)胞分化繁殖，同時(shí)阻止祖細(xì)胞進(jìn)入G2/M期進(jìn)行分裂增殖，從而使造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的比例和絕對(duì)值大大增高，獲得大量的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。通過(guò)使用不同的造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可定向擴(kuò)增不同的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及巨核細(xì)胞和血小板。CD?34＋細(xì)胞通常被公認(rèn)為造血祖細(xì)胞，因?yàn)镃D34抗原只在CFU-GEMM、CFU-MK、CFU-GM和BFU-E等造血祖細(xì)胞中表達(dá)。在本專(zhuān)利技術(shù)的又一實(shí)施例中，采用從人臍帶血分離出來(lái)的CD?34＋細(xì)胞作為研究對(duì)象，將TSP與CD34＋細(xì)胞共孵育3天，然后再加入抗腫瘤藥物孵育24小時(shí)。與對(duì)照組相比，TSP對(duì)人臍帶血CD?34＋細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，表明TSP對(duì)小鼠的作用同樣適用于人體。本專(zhuān)利技術(shù)的造血前體細(xì)胞保護(hù)劑可用于治療腫瘤和其它疾病的化學(xué)治療或放射治療誘發(fā)的血細(xì)胞減少，特別是血小板減少，還可促使大劑量化學(xué)療法的開(kāi)展，促進(jìn)腫瘤的治愈。本專(zhuān)利技術(shù)的造血前體細(xì)胞保護(hù)劑還可用作體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞試劑，從人臍帶血、骨髓或胚肝細(xì)胞中大量擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，用于供者本人或其他人在患血細(xì)胞或血小板減少癥、各種骨髓移植適應(yīng)癥時(shí)輸注或移植等臨床治療使用，或冷凍保存，建立細(xì)胞庫(kù)待用。本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例中使用的TSP系按Dubernard和Legrand的方法(J.Lab.&Clin.Med.，118：446-457，1991)分離得到。TSP1-174為用大腸桿菌(E.Coli)表達(dá)的基因重組蛋白質(zhì)，由以色列Biotech-nology?General?Ltd.提供。下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明本專(zhuān)利技術(shù)，但本專(zhuān)利技術(shù)并不局限于這些實(shí)施例。-->實(shí)施例1取Balb/c小鼠的骨髓細(xì)胞，用血漿凝塊法(Han等，Br.J.Haematol，81：1-5，1992和J.Lab.&Clin.Med.，123：610-6，1994)，將細(xì)胞(2×105/培養(yǎng)皿)加入含2-巰基乙醇10本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種造血前體細(xì)胞保護(hù)劑，其特征在于，以凝血酶致敏蛋白和／或其活性片段為有效成分。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種造血前體細(xì)胞保護(hù)劑，其特征在于，以凝血酶致敏蛋白和/或其活性片段為有效成分。2.如權(quán)利要求1所述的保護(hù)劑，其特征在于，所述活性片段至少含凝血酶致敏蛋白N-末端第1至第174個(gè)氨基酸殘基。3.如權(quán)利要求2所述的保護(hù)劑，其特征在于，所述活性片段由凝血酶致敏蛋白N-末端第1至174個(gè)氨基酸殘基組成。4.如權(quán)利要求1所述的保護(hù)劑在體外擴(kuò)增造血前體細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，將所述保護(hù)劑與造血前體細(xì)胞共孵育。5.如權(quán)利要求1所述的保護(hù)劑在體外擴(kuò)增造血前體細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，將所述保護(hù)劑和造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子與造血前體細(xì)胞共孵育。6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：韓忠朝，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海貝特生物技術(shù)有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：31[中國(guó)|上海]