狂犬疫苗特異性免疫增強劑的制備方法技術

本發明專利技術提供了一種狂犬疫苗特異性免疫增強劑的制備方法，它選用豬作免疫動物，將狂犬病疫苗注入豬體內一段時間后，采血樣測定其效力單位，然后將豬宰殺，收集脾臟置于低溫保存備用。制作時，將脾臟用生理鹽水洗干凈，將其切碎置于高速組織攪拌機中加等量生理鹽水攪拌，然后采用凍融法制備出狂犬疫苗特異性免疫增強劑。（*該技術在2013年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及到一種生物藥品的制備方法，特別是一種。人類感染狂犬病毒后一旦發病，死亡率則為100%。目前，唯一有效的是注射狂犬病疫苗和抗狂犬病血清，抗狂犬病血清能延長狂犬病發病潛伏期，給疫苗的自動免疫創造條件，但不能完全保護發狂犬病，而狂犬病疫苗也沒有100%的保護率。根據有關已接種疫苗后仍然發病的例子進行分析的報導，潛伏期＜30天的占66.2%，免疫后抗體陽性率50%，仍有50%為免疫空白，抗體陰性的接種人群仍潛伏著高度發病的危險性。這類人群可能是與肌體免疫功能失調有關。本專利技術的目的是提供一種新的技術制備狂犬病特異性豬脾轉移因子(PSR.V-TF)，用來調節機體免疫功能，配合狂犬病疫苗以促使機體盡早產生抗體，提高抗體陽性率，減少死亡率。本專利技術的技術解決方案是這樣的選用豬作免疫動物，將狂犬病疫苗注入豬體內一段時間后，采血樣測定其效力單位，當達到10u/ml以上后宰殺，收集脾臟置低溫保存備用。制作時，將脾臟用生理鹽水清洗干凈，將其切碎置于高速組織攪拌機中加等量滅菌生理鹽水攪拌，然后采用凍融法制備出狂犬疫苗特異性免疫增強劑。其詳細制作過程如下a、豬免疫狂犬病疫苗選擇健康豬作免疫動物，豬的重量在50kg左右為最佳，先抽血檢測出有先天狂犬抗體及HBsAg等陰性的豬進行免疫狂犬病疫苗，抗原為組織培養人用狂犬病疫苗，免疫程序參照WHO的免疫程序(0、3、7、15、21、30天)，共6針，每針肌注4ml。間隔兩個月后加強免疫3針(0、7、14天)，即每針相隔7天，每針4ml。加強免疫20天后采血樣，按中國藥品生物制品檢定所《人用精制抗犬病血清國際單位檢定方法》測定效力單位，達到10u/ml以上后宰殺收集脾臟置低溫保存備用。b、狂犬疫苗特異性免疫增強劑的制作將收集的脾臟除去脂肪包膜及結締組織等，用生理鹽水洗2～3次，然后將脾臟切碎置于高速組織攪拌機中，加等量滅菌生理鹽水攪拌3分鐘，取出置于密封容器中，置于-15～-20℃速凍箱中速凍，然后取出在常溫下解融，解融后再置于-15～-20℃的速凍箱中速凍，然后又取出在常溫下解融，如此反復八次，然后再裝入無菌透析袋中，加適量滅菌生理鹽水，放置于4℃冰箱內透析24小時，傾出透析液，如此反復透析3次，合并三次透析液，經玻璃濾器過濾除菌后，在無菌的條件下定量灌入經180℃干烤4小時的無菌安瓶內，經低溫冷凍干燥后封口。狂犬病特異性豬脾轉移因子(即PSR.V-TF)檢測結果 PSR.V-TF的臨床實驗(一)對象與方法1、對象選擇107人為實驗對象(刪除有過敏史、HBsAg陽性、哮喘及免疫功能異常者)，隨機分成三組，1、4、7為實驗組，2、5、8為對照組Ⅰ，3、6、9為對照組Ⅱ。2、方法實驗組應用狂犬病疫苗加PSR.V-TF，對照組Ⅰ用狂犬病疫苗加PS-TF，對照組Ⅱ單用狂犬病疫苗。三組均使用衛生部武漢生物制品所生產的同一批號狂犬疫苗，批號911241-7.25iu，每人份2ml×5支，免疫程序按WHO提出的0、3、7、14、30天各一支，肌注、PSR.V-TF批號920117。PS-TF廣州軍區南岳制藥廠生產，批號900927-5，PSR.V-TF組與PS-TF組、1支/隔日肌注，10支為一療程。4、狂犬抗體檢測方法免疫前均采血作狂犬體檢測有無先天及后天狂犬抗體，首針免疫后第15天、30天、45天、150天各采耳垂血0.2ml，用毛細玻璃管吸血分裝。狂犬抗體檢測采用雙盲法進行。酶聯免疫吸附檢測法。三組狂犬抗體產生的時間陽性率及抗體水平的比較，見表一、表二、表三。表一兩組狂犬抗體產生時間、陽性率及抗體水平的比較首針實驗組對照組I免疫P值后觀察陽性%OD觀察陽性%OD天數例數例數例數例數15312580.650.25351440.00.15t=3.51p<0.0130313096.770.40352571.420.24t=4.44p<0.01453131100.00.53353291.420.33t=4.58p<0.01150312167.470.32351542.850.23t=1.96p<0.05表二兩組狂犬抗體產生時間、陽性率及抗體水平的比較首針實驗組對照組II免疫P值后觀察陽性%OD觀察陽性%OD天數例數例數例數例數15312580.650.25321237.500.14t=3.84p<0.0130313096.770.40322371.870.24t=4.45p<0.01453131100.00.53322990.620.33t=4.96p<0.01150312167.470.32321340.620.19t=3.3p<0.01表三兩對照組抗體產生時間、抗體陽性率及抗體水平的比較首針對照組I對照組II免疫P值后觀察陽性%OD觀察陽性%OD天數例數例數例數例數15351440.000.15321237.50.14t=0.337p>0.0530352571.420.24322371.870.24t=0.175p>0.0545353291.420.33322990.620.33t=0.227p>0.05150351542.850.2332130.620.19t=1.098p>0.05從表1可見首針免疫后，實驗組陽性率為80.65%，對照組Ⅰ陽性率40.00%平均OD值實驗組為0.27，對照組Ⅰ只有0.15、t＝3.51 p＜0.01，隨著時間延長，30天實驗組與對照組Ⅰ陽性率與OD值也隨著有上升。兩組比較仍有顯著性差異，t＝4.44 p＜0.01，兩組在45天抗體陽性率達高峰期(100%/91.4%)基本觸近，但兩組OD值還是有非常顯著性差異，t＝4.58 p＜0.01，在150天兩組抗體都下降，但實驗組陽性率為67.47%，OD值0.32，而對照組Ⅰ陽性率為42.85%，OD值只有0.23，t＝1.96 p＜0.05，仍有顯著性差異。從表2看，兩組從首針免疫后15天、30天都有顯著性差異，45天實驗組抗體陽性率達高峰100%，OD值0.53，對照組Ⅱ抗體陽性率達90.62%，OD值0.33，兩組陽性率也基本接近，但實驗組OD值高出0.2(0.53-0.33) t＝3.3 p＜0.01，從150天兩組比較，實驗組比對照組陽性率高出26.85%(67.47-40.62)，OD值高出0.13(0.32-0.19)t＝0.33p＜0.01。對照組Ⅰ與對照組Ⅱ均無顯著差異，見表三。本次實驗觀察107人，免疫前狂犬抗體陽性為0，其中剔除了未按全程免疫的及未按時采血作狂犬抗體檢測的19人外，實驗組31人，對照組Ⅰ35人，對照組Ⅱ32人，共98人。從本次臨床免疫效果觀察，PSR.V-TF配合狂犬疫苗免疫。(1)、對接種人群能提早了15天以上產生抗體，實驗組15天陽性率為80.65%，而對照組Ⅰ與對照組Ⅱ30天，抗體陽性率只有(71.42/71.87)、(80.65-71.42/71.87)。(2)、促進接種人群免疫功能，提高了抗體水平，從表1和表2中看出，實驗組比對照組Ⅰ、Ⅱ組OD均有非常顯著性差異。(3)、增本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種狂犬疫苗特異性免疫增強劑的制備方法，其特征是：ａ、豬免疫狂犬病疫苗，選擇健康豬作免疫動物，豬的重量在５０ｋｇ左右為最佳，先抽血檢測出有先天狂犬抗體及ＨＢＳＡｇ等陰性的豬進行免疫狂犬病疫苗，抗原為組織培養人用狂犬病疫苗，免疫程序參照Ｗ ＨＯ的免疫程序（０、３、７、１５、２１、３０天），每針肌注４ｍｌ，共６針，間隔兩個月后加強免疫３針（０、７、１４天），即每針相隔７天，每針４ｍｌ，加強免疫２０天后采血樣，按中國藥品生物制品檢定所《人用精制抗犬病血清國際單位檢定方法》測定效力單位，達到１０↑［μ］／ｍｌ以上后宰殺收集脾臟置低溫保存備用；ｂ、狂犬疫苗特異性免疫增強劑的制作，將收集的脾臟除去脂肪包膜及結締組織等，用生理鹽水洗２～３次，然后將脾臟切碎置于高速組織攪拌機中，加等易滅菌生理鹽水攪拌３分鐘，取出置于密封 容器中，置于－１５～－２０℃速凍箱中速凍，然后取出在常溫下解融，解融后再置于－１５～－２０℃的速凍箱中速凍，然后又取出在常溫下解融，如此速凍、解融反復８次，然后再裝入無菌透析袋中，加適量滅菌生理鹽水，放置于４℃冰箱內透析２４小時，傾出透析液，如此反復透析３次，合并３次透析液，經玻璃濾器過濾除菌后，在無菌的條件下灌入經１８０℃干烤４小時的無菌安瓶內，經低溫冷凍干燥后封口。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳榮祥，陳傳良，袁少東，文美華，汪聯榮，譚云球，
申請(專利權)人：衡山縣衛生防疫站，
類型：發明
國別省市：43[中國|湖南]