乳清蛋白規模純化的制備方法技術

一種生物醫藥技術領域的乳清蛋白規模純化的制備方法。包括如下步驟：合成牛乳β－乳球蛋白專一的親和分離材料：首先以帶氨基的基礎層析介質，或對基礎層析介質進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與三乙烯四胺反應，合成親和分離材料，即得到α－乳清白蛋白純品；用制備的仿生親和分離材料純化β－乳球蛋白；乳清經加熱處理后，用以上制備的仿生親和分離材料純化α－乳清白蛋白。本發明專利技術克服了α－乳清白蛋白純化技術中的缺點，減少了α－乳清白蛋白生產中分離純化步驟，降低了生產成本，提高了生產效率，利用對β－乳球蛋白專一的親和分離材料，可快速、簡便、低成本、大批量純化α－乳清白蛋白。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及的是一種生物醫藥
的制備方法。特別是一種乳清蛋白規模純 化的制備方法。
技術介紹
α _乳清白蛋白則廣泛地存在于所有哺乳動物的乳中，是β -1，4-半乳糖苷轉移 酶的調節亞基，催化乳糖的合成。乳糖是調控乳滲透壓的主要因子。α-乳清白蛋白的氨基 酸組成中包含大量的人體營養所必需的氨基酸，因而具有重要的營養價值。此外，人α-乳 清白蛋白多聚體或折疊變異體能夠誘導腫瘤細胞凋亡，是一種潛在的臨床藥物。通過轉基 因技術，在牛乳腺中特異表達人α-乳清白蛋白，生產重組人α-乳清白蛋白，即可增強其 營養價值，又可為獲得大量人α-乳清白蛋白提供源料來源，用于臨床藥物研究和作為各 種保健食品添加劑。經過對專利文獻檢索發現，中國專利200510012225. X “一種去除乳中β -乳球蛋 白，提取高純度免疫球蛋白的方法”，采用等電點沉淀和離子交換兩步法去除β 乳球蛋白， 不僅回收率低，且選擇性低，純度也不高；中國專利200710102036 “一種從轉基因牛乳中純 化重組人α -乳清白蛋白的方法”利用陰離子交換和凝膠過濾結合的方法，先用陰離子交 換獲得α-乳清白蛋白的粗制品，再通過凝膠過濾精制；該純化方法步驟較多，操作復雜， 凝膠過濾在生產上效率低，成本高。美國專利5，986，063，用了陽離子交換層析和ρΗ梯度 洗脫，β-Lg和α-乳清白蛋白的回收率低，純度有限；美國專利5，503，864是結合了等電 點沉淀和膜過濾的方法，雖然操作簡便，但是選擇性低，產品純度低。因此，有必要開發效率 高、成本低、生產步驟更簡便的α-乳清白蛋白的生產工藝。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服α -乳清白蛋白制備方法現有技術的缺點，提供一種乳清 蛋白規模純化的制備方法。本專利技術以專一性地識別乳球蛋白作為基礎，將牛乳乳球 蛋白的親和分離材料和牛乳乳球蛋白、α-乳清白蛋白的親和純化，本專利技術能夠快速、 簡便、低成本、大批量純化α-乳清白蛋白。本專利技術是通過以下技術方案實現的本專利技術包括步驟如下第一步，合成牛乳乳球蛋白專一的親和分離材料首先以帶氨基的基礎層析 介質，或對基礎層析介質進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與三乙烯四胺 反應，合成親和分離材料，即得到α -乳清白蛋白純品。第一步中所述的所述基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚 糖和Ν，Ν’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、 聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠中一種。第二步，用制備的仿生親和分離材料純化β-乳球蛋白。3第二步中所述的仿生親和分離材料的配體中含有三氮嗪和三乙烯四胺的結構。第二步中所述的純化β-乳球蛋白，其方法如下用合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將牛乳清樣品流經該親和層析柱，牛 乳乳球蛋白吸附在親和層析柱上，未結合的其它蛋白被洗去，改變緩沖液條件將結合 的牛乳乳球蛋白洗脫下來，得到牛乳乳球蛋白粗品；所述的親和分離材料，其吸附β-乳球蛋白的條件為PH 6.0-7.5，NaCl濃度為 0. 0-0. 2Μ 的 NaCl 緩沖液。所述的親和分離材料，其純化β -乳球蛋白的洗脫條件為PH 2. 0-3. 0緩沖液和/ 或 ρΗ 5. 0-8. 5 含 0. 2-1. OM NaCl 的緩沖液。第三步，乳清經加熱處理后，用以上制備的仿生親和分離材料純化α-乳清白蛋白。第三步中乳清經加熱處理是指向去脂乳清中加入鹽，混勻、加熱并保溫后，冷卻， 然后去除沉淀，收集清液得濃縮乳球蛋白和α-乳清白蛋白。所述的加熱，其溫度至60°C -95°C ；保溫時間10min-60min ；所述的鹽，包括:LiCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、MnCl2、ZnCl2*FeCl3 中的一種，濃 度0. 15-0. 4M。第三步中所述的純化α-乳清白蛋白，其方法如下用合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將經過加熱處理的含有β -乳球蛋白 和α-乳清白蛋白牛乳清樣品，流經該親和層析柱，乳球蛋白吸附在親和層析柱上，未 結合α-乳清白蛋白被洗去，收集流穿，得到α-乳清白蛋白粗品。所述的乳球蛋白和所述的α-乳清白蛋白，原料為普通牛乳和含重組人 α-乳清白蛋白的轉基因牛乳和人乳中的一種。本專利技術將α-乳清白蛋白生產中分離純化步驟減少到了 2步，其中預處理可以實 現α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白總含量達到99%以上，親和處理步驟取得了 β-乳球蛋 白純度98%，α-乳清白蛋白純度90%;因而能夠可快速、簡便、低成本、大批量純化α-乳 清白蛋白，降低生產成本，提高了生產效率。具體實施例方式以下對本專利技術的實施例作詳細說明以下實施例在以本專利技術技術方案為前提下進 行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本專利技術的保護范圍不限于下述的實施例，如起始 材料NH2-Si5Pharose可以更換成葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和Ν，Ν’-亞甲 基雙丙烯酰胺的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、聚丙烯酰胺/瓊 脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠等，這些等價形式同樣屬于本專利技術的 范圍。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商 所建議的條件。實施例1取_70°C凍存的轉基因牛乳樣品，37°C水浴融化，離心脫脂，取乳清分裝成多份，分 別調 CaCl2 終濃度 0. 0,0. 05，0. 1,0. 15，0. 2,0. 25，0. 3,0. 4M，然后分別在溫度70°C，75°C，4800C，85°C，90 V，950C 下加熱 IOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min ；反應完畢后，將各 管于4°C，12000rpm,離心lOmin，上清轉移至新管并透析除去CaCl2,沉淀用IOmM磷酸鈉緩 沖液，PH 7. O洗滌三次后各用200mL磷酸鈉緩沖液，PH 7. O溶起。13. 5% SDS-PAGE分析上 清和沉淀蛋白組成，同時對上清進行蛋白定量。濃縮樣品總α-乳清白蛋白和β-乳球蛋 白總含量最高可達到99%以上。表1顯示了不同濃度CaCl2加熱95°C處理5min效果；表 2顯示了 0. 2M CaCl2條件下加熱不同溫度處理20min的富集效果；表3顯示了加熱保溫不 同時間的效果。具體如下表 表本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種乳清蛋白規模純化的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：　　第一步，合成牛乳β－乳球蛋白專一的親和分離材料：首先以帶氨基的基礎層析介質，或對基礎層析介質進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與三乙烯四胺反應，合成親和分離材料，即得到α－乳清白蛋白純品；　　第二步，用制備的仿生親和分離材料純化β－乳球蛋白；　　第三步，乳清經加熱處理后，用以上制備的仿生親和分離材料純化α－乳清白蛋白。

【技術特征摘要】
一種乳清蛋白規模純化的制備方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，合成牛乳β 乳球蛋白專一的親和分離材料首先以帶氨基的基礎層析介質，或對基礎層析介質進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與三乙烯四胺反應，合成親和分離材料，即得到α 乳清白蛋白純品；第二步，用制備的仿生親和分離材料純化β 乳球蛋白；第三步，乳清經加熱處理后，用以上制備的仿生親和分離材料純化α 乳清白蛋白。2.根據權利要求1所述的乳清蛋白規模純化的制備方法，其特征是，第一步中所述的 基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺 的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物 珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠中一種。3.根據權利要求1所述的乳清蛋白規模純化的制備方法，其特征是，第二步中所述的 仿生親和分離材料的配體中含有三氮嗪和三乙烯四胺的結構。4.根據權利要求1所述的乳清蛋白規模純化的制備方法，其特征是，第二步中所述的 純化乳球蛋白，其方法如下用合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將牛乳清樣品流經該親和層析柱，牛乳 β-乳球蛋白吸附在親和層析柱上，未結合的其它蛋白被洗去，改變緩沖液條件將結合的牛 乳乳球蛋白洗脫下來，得到牛乳乳球蛋白粗品；5.根據權利要求1或者3或者4所述的乳清蛋白規模純化的制備方法，其特征是，所述 的親和分離材料，其吸附β -乳球蛋白的條件為PH 6. 0-7....

【專利技術屬性】
技術研發人員：李榮秀，霍晨曦，王一，翟東改，李雪，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]