本發明專利技術公開了一種利用金屬氧化物富集糖肽以及同時富集糖肽和磷酸化肽的方法。本方法特點在于利用金屬氧化物做為固相萃取材料，從蛋白酶解液中分離富集糖肽，并且利用簡單的操作可以從一份樣品中實現磷酸化肽和糖肽的同時富集。具體地說是在中性或弱酸性條件下將金屬氧化物和樣品混合，酸性條件洗脫得到糖肽，堿性條件洗脫得到磷酸化肽，可以在同一份樣品中實現磷酸化肽和糖肽的高效率、高選擇性的富集。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及糖肽和磷酸化肽的分離與純化，具體地說是一種利用金屬氧化物富集 糖肽以及同時富集磷酸化肽和糖基化肽的方法。
技術介紹
翻譯后蛋白質的修飾是蛋白質組學中的研究熱點課題，尤其是蛋白質的磷酸化和 糖基化，是存在最為普遍，研究最為廣泛的兩種翻譯后修飾過程。蛋白質的磷酸化幾乎調控 生命的整個過程，包括細胞的增殖，發育和分化，也是目前所知道的信號的主要傳遞方式之 一。同時，了解蛋白質的糖基化過程，對一些如癌癥炎癥等疾病的診斷和治療都是具有非常 重要的意義。目前，對于蛋白質翻譯后修飾過程的研究一個非常重要的手段就是利用生物 質譜解析蛋白質的肽段結構，但由于糖基化和磷酸化肽段離子化效率較低，質譜信號常常 受到非修飾肽段的抑制，嚴重干擾對修飾肽段的檢測。因此，在質譜分析前對磷酸化和糖基 化肽段的富集是非常必要的[Liu, X. ；Ma, L. ；Li, J. J. Anal. Lett. 2008,41,268 ；Morelle, W. ；Canis, K. ；Chirat, F. ；Faid, V. ；Michalski, J.C. Proteomics 2006,6,3993]。近年來，很多富集糖肽的方法被提出和應用。最為常見的就是凝集素的方法，這種 方法的選擇性較好，但同時存在著通用性不強的缺點，尤其在處理復雜樣品時很可能會丟 失不能與凝集素特異性結合的糖肽[J. Glycoconjugate J. 2004,21,35 ；Kubota, K. ；Sato, Y. ；Suzuki, Y. et al. Anal :Chem. 2008，80，3693]；化學方法如胼化學可以選擇性的富集糖 肽，但是這種方法丟失糖鏈的信息[Zhang, H. ；Li, X. J. ；Mart in, D. B. ；Aebersold, R. Nat. Biotechnol. 2003，21，660.]；親水作用色譜也能夠用來富集極性相對較大的糖肽，但是容 易受到具有相當極性的非糖肽的干擾[Wada, Y. ；Tajiri，M. ；Yoshida, S. Anal. Chem. 2004， 76,6560.]；硼酸能與順勢二醇形成硼酸酯結構也可以用來綁定糖肽，但這種方法的費時較 長[Zhou，W. ；Yao, N. ；Yao, G. P. ；Deng，C. H. ；Zhang，Χ. Μ. ；Yang，P. Y. Chem. Commun. 2008， 5577.]；石墨化碳與極性的糖肽發生偶極相互作用而加強對糖肽的保留，但是不適用于具 有較長肽段的糖肽。總之。目前還未見一種操作簡單通用性強的富集方法來選擇性的富集 糖肽。用金屬氧化物作為富集材料對糖肽進行富集目前未見報道。相較于糖肽的富集磷酸化肽的富集近年來發展迅速，以氧化鈦為代表的金屬氧 化物，在磷酸化肽富集方面展現了其選擇性高特異性好的特點[Pinkse，M.W.H. ；Uitto, P. M. ；Hilhorst, M. J. ；Ooms, B. ；Heck, A. J. R. Anal. Chem. 2004, 76, 3935 ；Larsen, Μ. R.； Thingholm, Τ. Ε. ；Jensen, 0. N. ；Roepstorff, P. ；Jorgensen, Τ. J. D. Mol. Cell. Proteomics 2005，4，873.]，已經被廣泛的應用到磷酸化蛋白質組學中。但是，用金屬氧化物在一次操作 中同時得到糖肽和磷酸化肽還未見報道。
技術實現思路
為解決上述難點，專利技術人通過研究氧化鈦微球對單糖和寡糖的色譜保留行為發 現，糖在氧化鈦色譜柱上有很強的保留，這種保留隨糖鏈的增長而增強，隨流動相酸性添加4劑的濃度增加而減少。專利技術人將氧化鈦微球的這個性質用于進行糖肽的富集，通過對結構 明確的標準糖蛋白的酶解液在不同條件下洗脫糖肽和非糖肽，實現了對糖肽的選擇性富 集。同時，由于氧化鈦可以同時保留糖肽和磷酸化肽，通過在酸性條件下洗脫糖肽，在堿性 條件下洗脫磷酸化肽，實現了糖肽和磷酸化肽的同時富集。，以金屬氧化物作為固 相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同時富集磷酸化肽和糖肽。所述金屬氧化物為氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁中的一種或多種復合金屬氧化物；金屬 氧化物材料形態為納米材料、微球材料以及金屬氧化物涂覆或包覆的球形或無定形材料。所述富集的過程為柱萃取，具體操作如下1)將金屬氧化物裝入萃取柱管中，將PH為5-8蛋白酶解物上樣到萃取柱中，蛋白 酶解物與金屬氧化物材料的重量比例為1 1 200;2)分別用1 10倍柱體積的鹽溶液、1 10倍柱體積的含有有機酸的乙腈水溶 液沖洗萃取柱，乙腈的體積濃度為0-95% ；；3)采用1 10倍柱體積的含有有機酸的乙腈水溶液洗脫糖肽，乙腈的體積濃度為 0-95% ；4)采用1 10倍的柱體積的0. 5-25wt%氨水洗脫得到磷酸化肽。所述富集的過程為離心或過濾，具體操作如下1)將金屬氧化物與pH為5-8的蛋白酶解物混合，蛋白酶解液中內含的蛋白酶解物 與金屬氧化物材料的重量比例為1 1 200，孵化1 180分鐘，離心或過濾分離，棄上層 溶液，收集沉淀；2)將2-100倍固體體積的鹽溶液、2-100倍固體體積的含有有機酸的乙腈水溶液 分別與沉淀混合震蕩1 180分鐘，乙腈的體積濃度為0-95%，離心或過濾分離，棄上層溶 液，收集沉淀；此過程重復1-10次；3)將1-50倍固體體積的含有有機酸的乙腈水溶液與沉淀混合震蕩1 180分鐘， 乙腈的體積濃度為0-95%，離心或過濾分離，收集上清液以及沉淀，上清液即為糖肽；4)將0. 5-25wt%氨水與沉淀混合震蕩1 180分鐘，離心或過濾分離，收集上清 液，棄去沉淀，上清液即為磷酸化肽。所述富集的過程采用金屬氧化物包覆磁珠進行，具體操作如下1)將pH為5-8磁珠與蛋白酶解物混合，蛋白酶解液中內含的蛋白酶解物與磁珠材 料的重量比例為1 1 200，孵化1 180分鐘，在磁場作用下分離磁珠和上清液，棄上層 溶液，收集磁珠；2)將2-100倍固體體積的鹽溶液、2-100倍固體體積的含有有機酸的乙腈水溶液 分別與磁珠混合震蕩1 180分鐘，乙腈的體積濃度為0-95%，在磁場作用下分離磁珠和上 清液，棄上層溶液，收集磁珠，此過程重復1-10次；3)將1-50倍固體體積的含有有機酸的乙腈水溶液與磁珠混合震蕩1 180分鐘， 乙腈的體積濃度為0-95%，在磁場作用下分離磁珠和上清液，收集上清液以及磁珠，上清液 即為糖肽；4)將1-50倍固體體積的0. 5_25wt %氨水與磁珠混合震蕩1 180分鐘，在磁場 作用下離心磁珠和上清液，收集上清液，磁珠可以再利用，清液即為磷酸化肽。所述鹽溶液為10 lOOOmmol/L氯化鈉、磷酸鹽、碳酸鹽中一種或多種；有機酸為 甲酸、乙酸或三氟乙酸；所述步驟幻中的有機酸溶液體積濃度為0 10%;步驟幻中的有 機酸溶液體積濃度為0. 01 20%。本專利技術具有如下優點1.本專利技術將金屬氧化物引入到糖肽富集的領域，通過氧化物表面的親水性質實現 了糖肽的選擇性富集。氧化鈦對糖肽的這種親和性是針對糖肽中的糖鏈的，所以具有很強 的普適性和很高的特異性。2.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
用金屬氧化物富集糖肽及同時富集糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于：以金屬氧化物作為固相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同時富集磷酸化肽和糖肽。
【技術特征摘要】
1.用金屬氧化物富集糖肽及同時富集糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于以金屬氧 化物作為固相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同時富集磷酸化肽和糖肽。2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述金屬氧化物為氧化鈦、氧化鋯、氧化 鋁中的一種或多種復合金屬氧化物。3.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述金屬氧化物材料形態為納米材 料、微球材料以及金屬氧化物涂覆或包覆的球形或無定形材料。4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述富集的過程為柱萃取，具體操作如下1)將金屬氧化物裝入萃取柱管中，將PH為5-8蛋白酶解物上樣到萃取柱中，蛋白酶解 物與金屬氧化物材料的重量比例為1 1 200 ；2)分別用1 10倍柱體積的鹽溶液、1 10倍柱體積的含有有機酸的乙腈水溶液沖 洗萃取柱，乙腈的體積濃度為0-95% ；3)采用1 10倍柱體積的含有有機酸的乙腈水溶液洗脫糖肽，乙腈的體積濃度為 0-95% ；4)采用1 10倍的柱體積的0.5-25wt%氨水洗脫得到磷酸化肽。5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述富集的過程為離心或過濾，具體操作 如下1)將金屬氧化物與PH為5-8的蛋白酶解物混合，蛋白酶解液中內含的蛋白酶解物與 金屬氧化物材料的重量比例為1 1 200，孵化1 180分鐘，離心或過濾分離，棄上層溶 液，收集沉淀；2)將2-100倍固體體積的鹽溶液、2-100倍固體體積的含有有機酸的乙腈水溶液分別 與沉淀混合震蕩1 180分鐘，乙腈的體積濃度為0-95%，離心或過濾分離，棄上層溶液，收 集沉淀；此過程重復1-10次；3)將1-50倍固體體積的含有有機酸的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：梁鑫淼，閆競宇，柯燕雄，李秀玲，張秀莉，薛興亞，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：91
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