絨山羊ＰＤＫ１基因ｃＤＮＡ編碼區(qū)核苷酸序列制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及從體外培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞分離的編碼ＰＤＫ１蛋白的ｃＤＮＡ的核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明專利技術(shù)通過比對已知的小鼠、大鼠、人、牛和豬的ＰＤＫ１基因ｃＤＮＡ的核苷酸序列，找到保守區(qū)，設(shè)計(jì)出了一對用于ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增絨山羊ＰＤＫ１基因ｃＤＮＡ編碼區(qū)片段的引物并用這對引物通過ＲＴ－ＰＣＲ方法擴(kuò)增出了特異性片段，測序后得到了絨山羊ＰＤＫ１基因ｃＤＮＡ的編碼區(qū)的６９８ｂｐ的核苷酸序列和與它的第２位～第６９７位核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列。獲得的這６９８ｂｐ的核苷酸序列可進(jìn)一步用于絨山羊ＰＤＫ１基因全長ｃＤＮＡ的克隆及用于通過ＲＴ－ＰＣＲ或雜交的方法檢測ＰＤＫ１基因的組織表達(dá)特異性，也可用于重組表達(dá)得到蛋白后制備檢測ＰＤＫ１的抗體。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及從體外培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞分離的編碼PDKl蛋 白的cDNA，更具體地說涉及編碼PDKl蛋白質(zhì)的cDNA編碼區(qū)698bp的核苷酸序列和與它的 第2位 第697位核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列。
技術(shù)介紹
細(xì)胞生長調(diào)控是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜過程，它不僅受到時(shí)間和空 間的限制，還受到營養(yǎng)條件和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境條件的影響。在營養(yǎng)條件合適并有其它刺激生 長的因子存在時(shí)，細(xì)胞通過生物大分子合成而使得質(zhì)量和形態(tài)都得到增長，此時(shí)則表現(xiàn)為 生長。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1 (3-phosphoinositide-d印endent protein kinase-1，PDK1/PDPK1)，是一個(gè)63KDa的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。作為細(xì)胞 中很多重要信號通路的中心樞紐，廣泛存在于人的很多組織中。起初，PDKl作為Akt 1 (PKB) 的上游活化激酶而被發(fā)現(xiàn)。1997年，Alessi等從兔子的骨骼肌中分離純化了一種蛋白激 酶，可以磷酸化PKB的Thr308位點(diǎn)，PKB的活性增加30倍以上。然后他們在一些磷酸肌醇 (PIs)存在的條件下檢測該激酶的活性，發(fā)現(xiàn)這種活化以一種依賴PIP3或PIP2的方式完 成，PDKl也就因此而得名。PKB的充分激活依賴磷酸化Thr308和Ser473氨基酸殘基。一般 認(rèn)為PDKl只可將Thr308位點(diǎn)磷酸化，而活化另一位點(diǎn)Ser473的上游激酶目前尚無定論。PDKl在激活A(yù)GC激酶家族成員中起著重要作用，除PKB外，PDKl還可能活化 PKC 的很多亞型，S6K(p70 ribosomal S6 kinases), RSK(p90 ribosomal S6 kinases), SGKs (serum-and glucocorticoid-inducedkinases)禾口 PKA (protein kinaseA)等。 被 PDKl激活的AGC激酶成員具有共同的結(jié)構(gòu)特征，即均含有兩個(gè)保守的區(qū)域，激酶活性區(qū)內(nèi) 的 T-Ioop 區(qū)(activation-loop)和羧基端的疏水性的 H-motif 區(qū)域(hydrophobicmotif)。 前者保守序列為T(F/L)CGT。后者保守序列為FXXF (S/T) (Y/F)，其中X為任意氨基酸。只有 這兩個(gè)保守區(qū)域同時(shí)磷酸化，激酶活性才被充分激活。PDKl中類似AGC家族的磷酸化位點(diǎn) Ser241可通過分子間二聚后的交叉自磷酸化促使PDKl活化，這也許可以解釋為什么哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中PDKl多為組成性活化。另外，Src作為PDKl的上游激酶可磷酸化Tyr373/376 和Tyr9兩個(gè)位點(diǎn)。而Tyr9的磷酸化不僅與Src有關(guān)，還會受到ROS(reactive oxygen species)的影口向。PDKl活化AGC家族成員的機(jī)制不盡相同，可大致分為四組。第一組為脂依賴的底 物，包括PKB和某些PKC亞型。PKB與細(xì)胞膜上的PIP3結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)從胞漿移位至胞膜， 并同時(shí)完成其構(gòu)型的轉(zhuǎn)變，以便處于近膜區(qū)的PDKl磷酸化其T-Ioop上的Thr308位點(diǎn)；在 T-Ioop活化完成的同時(shí)，由PDK2(ritor-mT0R)完成對PKB HM的磷酸化，并在其催化結(jié)構(gòu)域 (catalytic domain)內(nèi)通過α螺旋形成HM結(jié)合位點(diǎn)；最后，已發(fā)生磷酸化的HM結(jié)合到此 位點(diǎn)，促使PKB活化完全。而某些PKC亞型則是通過與佛波醇、甘油二酯、磷脂酰絲氨酸、卵 磷脂或ΡΙΡ3相互作用，轉(zhuǎn)化為PDKl的底物，從而完成T-Ioop活化，并且正是這種活化導(dǎo)致 了 PKC自身HM發(fā)生自磷酸化。第二組為磷酸化依賴的底物，包括S6K和SGK。與第一組不 同，這種底物的HM先發(fā)生磷酸化，然后促使PDKl通過其PIF(PDKl-interacting fragment) 結(jié)合區(qū)與該底物發(fā)生相互作用，進(jìn)而磷酸化底物的T-Ioop ；第三組為Rho依賴的底物，包括PRKl (PKC-related kinase)禾Π PRK2。這種底物先通過N端結(jié)合Rho的結(jié)構(gòu)域與Rho-GTP 發(fā)生相互作用，然后導(dǎo)致構(gòu)型改變，促使PDKl磷酸化其T-Ioop殘基。第四組為T-Ioop殘 基組成性活化的底物，包括PKA和RSK。迄今，關(guān)于PDKl在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長與增殖中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的研究已在小鼠、大 鼠、牛、人和豬等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中開展并取得了許多成果，但尚未見絨山羊細(xì)胞中PDKl 的研究報(bào)道，也未見有絨山羊PDKl基因的cDNA核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列的報(bào)道。在各種情況下，有重要的原因研究和開發(fā)與絨山羊PDKl蛋白相關(guān)的基因克隆及 其重組表達(dá)，因?yàn)檠芯壳宄q山羊的PDKl基因和蛋白的功能，可以用在提高細(xì)胞培養(yǎng)、胚 胎移植和發(fā)育及出生后新生兒的存活的質(zhì)量等方面，由重組PDKl蛋白制備的抗體可以檢 測PDKl基因在不同種類的細(xì)胞、不同的細(xì)胞周期及個(gè)體的不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)人已經(jīng)努力從絨山羊的不同組織細(xì)胞中分離PDKl基因。作 為結(jié)果，本專利技術(shù)人從絨山羊體外培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞分離了 PDKl基因的cDNA編碼區(qū) 698bp片段，并且確定了它的核苷酸序列和由它的第2位 第697位核苷酸序列推斷出的 氨基酸序列。本專利技術(shù)人通過比對已知的小鼠、大鼠、人、牛和豬的PDKl基因的核苷酸序列， 找到保守區(qū)，然后設(shè)計(jì)出了一對用于通過RT-PCR方法擴(kuò)增絨山羊PDKl基因cDNA編碼區(qū)片 段的引物(上游引物稱為P1，下游引物稱為P2)，并應(yīng)用這對引物擴(kuò)增出了特異性片段，測 序后得到了絨山羊PDKl基因的cDNA編碼區(qū)698bp片段，序列分析表明與與人的PDKl基 因(gb|BC012103. 1|)有88%的相似性，(622/699)，推導(dǎo)出的由此序列的第2位 第697 位核苷酸序列編碼的氨基酸序列與人的相比有14個(gè)氨基酸的差別。這一 cDNA片段稱為 “gPDKl”。所以，本專利技術(shù)的目的是通過已知的不同物種的PDKl的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，然后 通過RT-PCR方法克隆絨山羊PDKl基因的cDNA編碼區(qū)片段。對該片段測序后提供編碼絨 山羊PDKl蛋白的基因的cDNA的編碼區(qū)698bp的核苷酸序列和由此序列的第2位 第697 位核苷酸序列推斷的氨基酸序列(序列詳見序列表)。附圖的簡要說明從下面給出的說明結(jié)合附圖，本專利技術(shù)的上面目的的特征將變的明了。其中附圖說明圖1顯示了人PDKl基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陸號gb | BC012103. 1)。圖2顯示了 698bp的絨山羊PDKl基因的cDNA的編碼區(qū)核苷酸序列(SEQ ID NO 1)和由此序列的第2位 第697位核苷酸序列推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3是顯示從絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞分離的總RNA的RT-PCR的結(jié)果(698bp的 cDNA gPDKl)的電泳圖。圖4是顯示以質(zhì)粒pMD19-T-gPDKl為模板，以PI、P2為引物進(jìn)行PCR鑒定的電泳圖。圖5是顯示將質(zhì)粒pMD19-T_gPDKl進(jìn)行酶切鑒定的電泳圖。圖6顯示了絨山羊PDKl基因cDNA的編碼區(qū)核苷酸序列與人(gb | BC012103. 11) 的PDKl基因cDNA的序列的比較。具體實(shí)施方式本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
本專利技術(shù)涉及一段從體外培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞分離的編碼ＰＤＫ１蛋白的ｃＤＮＡ，更具體地說涉及編碼ＰＤＫ１蛋白質(zhì)的ｃＤＮＡ編碼區(qū)核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列。目前應(yīng)用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆基因并獲得相應(yīng)的核苷酸序列是獲得基因（ｃＤＮＡ）核苷酸序列的常用方法。本項(xiàng)專利技術(shù)設(shè)計(jì)了一對引物并應(yīng)用這對引物通過ＲＴ－ＰＣＲ方法擴(kuò)增出了絨山羊ＰＤＫ１基因ｃＤＮＡ的編碼區(qū)特異性片段，經(jīng)過測序后得到這一片段的６９８ｂｐ的核苷酸序列，其特征是在還沒有絨山羊ＰＤＫ１基因核苷酸序列的情況下，通過比較已知的小鼠、大鼠、人、牛和豬的ＰＤＫ１基因的核苷酸序列，找到保守區(qū)，設(shè)計(jì)ＰＣＲ簡并引物，進(jìn)而通過ＲＴ－ＰＣＲ方法擴(kuò)增出了絨山羊ＰＤＫ１基因ｃＤＮＡ的編碼區(qū)片段，測序后得到了６９８ｂｐ的核苷酸序列和與它的第２位～第６９７位核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列，這一絨山羊ＰＤＫ１基因ｃＤＮＡ編碼區(qū)片段的核苷酸序列和與它的第２位～第６９７位的核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列在國內(nèi)外是首次獲得。基于上述說明的本專利技術(shù)的技術(shù)特征，本專利技術(shù)的獨(dú)立權(quán)利要求表述為：一種自絨山羊分離的多核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列，是下列序列之一：１）序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的ｃＤＮＡ序列；２）與序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的ｃＤＮＡ序列第２位～第６９７位核苷酸之間的６９６ｂｐ的核苷酸序列對應(yīng)的標(biāo)注為ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的氨基酸序列。...

【技術(shù)特征摘要】
1.本發(fā)明涉及一段從體外培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞分離的編碼PDK1蛋白的 cDNA，更具體地說涉及編碼PDK1蛋白質(zhì)的cDNA編碼區(qū)核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序 列。目前應(yīng)用RT-PCR方法克隆基因并獲得相應(yīng)的核苷酸序列是獲得基因(cDNA)核苷酸序 列的常用方法。本項(xiàng)發(fā)明設(shè)計(jì)了一對引物并應(yīng)用這對引物通過RT-PCR方法擴(kuò)增出了絨山 羊PDK1基因cDNA的編碼區(qū)特異性片段，經(jīng)過測序后得到這一片段的698bp的核苷酸序列， 其特征是在還沒有絨山羊PDK1基因核苷酸序列的情況下，通過比較已知的小鼠、大鼠、人、 牛和豬的PDK1基因的核苷酸序列，找到保守區(qū)，設(shè)計(jì)PCR簡并引物，進(jìn)而通過RT-PCR方法...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王志鋼，劉東軍，旭日干，
申請(專利權(quán))人：王志鋼，劉東軍，旭日干，
類型：發(fā)明
國別省市：15[中國|內(nèi)蒙]