本發明專利技術公開了布魯氏菌的一種保護性抗原Ｏｍｐ２５ｃ蛋白及其在制備布魯氏菌疫苗中的應用。實驗結果表明，與野生型疫苗株相比，ｏｍｐ２５ｃ突變株毒力減弱，說明ｏｍｐ２５ｃ基因在疫苗株的毒力中發揮一定的作用。ｏｍｐ２５ｃ缺失株誘導的體液和細胞免疫水平及免疫保護效果均下降，說明ｏｍｐ２５ｃ對疫苗株的免疫應答和免疫保護效果有促進作用。由此可見，Ｏｍｐ２５ｃ蛋白是布魯氏菌的一個重要保護性抗原，能夠增強疫苗株誘導的免疫反應及其保護效果，以其為活性成份制備布魯氏菌疫苗，可提高疫苗的免疫保護效果。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及蛋白的新用途，特別是涉及布魯氏菌疫苗株M5的重要免疫保護性抗 原0mp25c蛋白在制備布魯氏菌疫苗中的應用。
技術介紹
布魯氏菌病(brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一類 動物源性疾病，是一種重要的人畜共患病，在世界范圍內廣泛流行。布魯氏菌可感染人 類、多種家畜和野生動物，病人主要癥狀為慢性關節炎及神經損傷，病畜主要表現為流產 和不育(尚德秋.布氏菌病研究進展.中國地方病防治雜志2004，19 =204-212 ；Corbel, Μ. J. Brucellosis :an overview. Emerg Infect Dis 1997，3 :213-21.)。布病不僅給我國畜 牧業生產造成巨大的經濟損失，也嚴重威脅人民的健康生活。另外，布魯氏菌還被用作生物 武器，對國家安全存在著嚴重的威脅。近年來布病的發病率呈上升趨勢，我國布病的發病率 已經超過歷史最高水平，引起相關部門的高度重視。布魯氏菌的外膜蛋白最早于20世紀80年代早期被發現，外膜蛋白在穩定細菌 外膜的結構、適應胞內外環境和抵抗胞內殺菌機制等方面起著重要作用，與布魯氏菌的 毒力密切相關，同時也是免疫原性蛋白的重要來源(Schurig G G，Sriranganathan N， Corbel M J.Brucellosis vaccines :past,present and future. Vet Microbiol 2002,90 479-496.)。因此，很多有關布魯氏菌致病機制和免疫反應機制的研究都集中在外膜蛋白 的研究上。Jos印h P. Connolly等在進行牛布魯氏菌的免疫蛋白質組研究時，發現0mp25c 是牛布魯氏菌的免疫原性蛋白(Connolly，J. P. et al. Proteomicanalysis of Brucella abortus cell envelope and identification of immunogeniccandidate proteins for vaccine development. Proteomics 2006.6:3767-80.)。但并非所有的免疫原性蛋白都具 有免疫保護性，如0!11 31，8 沈等免疫原性蛋白就沒有免疫保護性。專利技術人在前期的羊布魯 氏菌外膜蛋白質組研究中也發現，0mp25c蛋白是羊布魯氏菌外膜蛋白的主要成員，但是該 蛋白在羊布魯氏菌毒力和免疫保護性方面是否起著重要作用仍不清楚，專利技術人通過在疫苗 株中缺失omp25c并分析其毒力和免疫保護性的改變，來探討omp25c蛋白在布魯氏菌疫苗 中的作用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供0mp25c蛋白的一種新的醫藥用途。專利技術人的研究表明，0mp25c蛋白在布魯氏菌疫苗的保護性中起著重要作用，具有 增強布魯氏菌免疫保護性的作用，可以在制備布魯氏菌疫苗中得到廣泛應用。本專利技術所提供的布魯氏菌疫苗的活性成份為上述可激發機體對布魯氏菌產生免 疫力的保護性抗原0mp25c蛋白。免疫原性蛋白0mp25c在制備布魯氏菌抗體的免疫保護性蛋白中的應用也屬于本 專利技術的包括范圍。本專利技術提供的免疫保護性抗原，可以在布魯氏菌疫苗株高表達，從而進一步提高 疫苗的免疫保護效果。本專利技術提供一種0mp25c蛋白的新用途，即在制備布魯氏菌疫苗中的應用。為分析 0mp25c對布魯氏菌疫苗株M5的毒力及免疫保護性的影響，本專利技術首先表達了 0mp25c蛋白， 確認它們的免疫原性，然后構建M5的omp25c基因缺失突變株，比較缺失突變株和疫苗株的 毒力和免疫保護性，對0mp25c蛋白的免疫保護性進行分析。與M5比較，omp25c突變株在小 鼠脾臟內的存活時間較短，在第4周時未能被檢出。抗體水平檢測結果表明，omp25c突變株 和M5疫苗株在Balb/c小鼠體內均能誘導產生特異性抗體，但是與M5相比，突變株引起的 體液免疫應答相對較弱，持續時間較短。而且突變株誘導產生反映體液免疫應答的細胞因 子IL-10的水平也遠比M5低。突變株和M5疫苗株的小鼠脾淋巴細胞均能分泌IFN- γ，但 是突變株IFN-Y濃度明顯低于疫苗株。免疫應答結果表明，突變株的體液和細胞免疫應答 能力明顯下降，免疫原性減弱。攻毒實驗結果表明，接種了 omp25c突變株的小鼠用16M攻 毒后，免疫保護效果下降，與M5疫苗株存在顯著的差距。實驗結果表明，與疫苗株M5相比， omp25c突變株毒力減弱，說明omp25c基因在M5疫苗株的毒力中發揮一定的作用。omp25c 的缺失使得M5誘導的體液和細胞免疫水平及免疫保護效果下降，說明omp25c對疫苗株M5 的免疫應答和免疫保護效果有一定的影響。由此可見，外膜蛋白0mp25c在布魯氏菌疫苗株 M5的毒力和免疫保護性方面發揮重要的作用，是布魯氏菌疫苗的關鍵成份，可以其為活性 成份制備布魯氏菌疫苗。下面結合具體實施例對本專利技術做進一步詳細說明。附圖說明圖1為重組蛋白0mp25c的SDS-PAGE檢測結果圖2為重組蛋白0mp25c的免疫原性分析結果圖3為含突變盒N-K-C的重組質粒pUC19K-NC的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖4為omp25c缺失突變株的PCR鑒定結果圖5為omp25c缺失突變株在小鼠脾臟內的存活能力檢測結果圖6為小鼠血清總IgG水平檢測結果圖7為IFN-Y檢測結果圖8為IL-10檢測結果圖9為免疫保護實驗結果具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。本專利技術中，0mp25c表示蛋白， 斜體小寫omp25c表示基因。 實施例1、0mp25c蛋白的表達及免疫原性分析一、0mp25c蛋白的表達1、表達引物的設計B. melitensis 16M已完成全基因組測序，根據GenBank中收錄的16M序列及注釋 信息(GenBank號AE008918)，用SignalP軟件分析基因的信號肽序列并去除相應的信號肽序列，DNAMar軟件分析蛋白的抗原性及疏水性后，用I^rimer Premier 5 (PREMIERBiosoft International,Palo Alto)設計 0mp25c 蛋白的特異性表達引物BMEI18^-E_F :3，-ACGT GGATCCGACGCCGTCATTGAACAGG-5’ 和 BMEI1829-E-R 3’ -AGCTAAGCTTGAACTTGTAAGCGACACCG-5 ’。再根據表達載體PET3M的多克隆酶切位點信息在上游引物的5’端添加BamH I酶切位 點，在下游引物的5’端添加Hind III酶切位點。2、重組表達載體的構建以16M基因組為模板，使用上述引物BMEI18^-E-F和BMEI1829-E-R用PCR的 方法擴增omp25c基因。PCR反應體系為10XPCR緩沖液5μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，上游 引物(20 μ Μ) 0. 5 μ 1，下游引物(20 μ Μ) 0. 5ul，rTaq 酶(5U/y 1)0. 25 μ 1，模板 DNA(10ng/ μ 1)1 μ 1，加水補齊至終體積 50μ 1。PCR 反應條件為94°C 5min ；95°C 30s,56°C 30s， 72°C 60s本文檔來自技高網...
【技術保護點】
Ｏｍｐ２５ｃ蛋白在制備布魯氏菌疫苗中的應用。
【技術特征摘要】
1.0mp25c蛋白在制備布魯氏菌疫苗中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王玉飛，陳澤良，曲勍，鐘志軍，徐杰，汪舟佳，杜昕穎，孫巖松，黃留玉，
申請(專利權)人：中國人民解放軍疾病預防控制所，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]
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