制備蛋白質酯和蛋白質亞基酯的方法技術

制備蛋白質酯和／或蛋白質亞基酯的方法，所述方法包括將酰基供體、酰基受體與水混合以產生包含５－９８％水的高水分環境，其中所述酰基供體是選自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂組成的組中的一或多種的脂質底物，且所述酰基受體是蛋白質和／或蛋白質亞基；以及將所述混合物與脂質酰基轉移酶接觸，使得所述脂質酰基轉移酶催化以下反應中的一或所有兩種：醇解或酯基轉移作用。本發明專利技術還涉及所述脂質酰基轉移酶在制備蛋白質酯和／或蛋白質亞基酯中的應用。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及通過利用脂質酰基轉移酶對脂質進行生物轉化以制備碳水化合物酯 和/或蛋白質酯和/或蛋白質亞基酯和/或羥基酸酯(hydroxy acidester)的方法。本專利技術還涉及脂質酰基轉移酶在對脂質進行生物轉化使其成為以下一或多種物 質中的用途碳水化合物酯和/或蛋白質和/或蛋白質亞基酯和/或羥基酸酯。本專利技術還涉及本文固定化的脂質酰基轉移酶的用途，該固定化的脂質酰基轉移 酶可用于在高水分環境中對脂質進行生物轉化以制備一或多種碳水化合物酯和/或蛋白 質酯和/或蛋白質亞基酯和/或羥基酸酯。本專利技術還涉及固定化的脂質酰基轉移酶.
技術介紹
脂酶已經廣泛用于脂質的生物轉化以制備高價值產品，例如糖酯，以便用 于廣泛的工業中，包括食品和/或飼料工業，化妝品和/或皮膚護理工業，油化學 (oleochemical)工業和制藥工業。當生物轉化過程需要脂質底物水解時，脂解酶可用于高水分環境中。然而，當 生物轉化過程需要酯交換反應或酯基轉移反應諸如通過醇解，由于不需要的水解反應利 用酯酶高水分環境可以是有害的，所述不需要的水解反應可導致不需要的生物產物和/ 或使得生物轉化產物的產量較低。通常，需要酯交換作用和/或酯基轉移作用的生物轉化過程利用非-水環境中的 酯酶，所述非-水環境諸如油系統和/或有機溶劑系統諸如丁醇，甲醇或己烷。這樣的 系統提供這樣的環境，其中極性受體分子和脂質供體分子可以至少部分溶解，且所述酯 酶具有足夠的酶活性。盡管少量水是任何酶活性所需的，水的量嚴格保持在較低水平以 避免該酶的水解活性。通常，糖酯，蛋白質酯，羥基酸酯已經通過化學合成利用無機催化物產生。常 規生物轉化法制備糖酯或羥基酸酯利用有機溶劑環境或僅存在少量水的超臨界液體中的酯酶。Lecointe et al Biotechnology Letters, Vol 18., No.8 (August)，pp869-874 公開了 對多種脂酶的研究，以及它們在含水介質中的活性，所述研究根據分別來自甲醇和丁醇 的甲基酯或丁基酯。Lecointe et al教導來自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的酯酶/酰基轉移酶，其隨甲醇或丁醇濃度增加顯示降低的水解活性以及增強的產生甲基酯和丁 基酯的能力。來自近平滑念珠菌的酯酶/酰基轉移酶在制備脂肪羥氨基(hydroxamic)酸 中的用途在 Vaysseetal J.of Biotechnology 53 (1997) 41-46 中教導。脂酶膽固醇酰基轉移酶(cholesterol acyltransferase)已經是已知的(參見例如 Buckley-Biochemistry伯克利生物化學1983，22，5490-5493)。具體地，已經發現甘油磷 脂膽固醇酰基轉移酶(GCAT)，它很象植物和/或哺乳動物卵磷脂膽固醇酰基轉移酶 (LCAT)，可以催化脂肪酸在卵磷脂與膽固醇之間的轉移。厄普頓(Upton)和伯克利(Buckley)(TIBS 20，May 1995p 178-179)及布魯米爾 科(Brumlik)和伯克利(Buckley) (J.of Bacteriology Apr. 1996 p2060-2064)教導了源自嗜水 氣單胞菌(Aeromonahydrophila)的脂酶/酰基轉移酶能夠在水介質中將酰基轉移到乙醇 受體上。
技術實現思路
本專利技術第一方面提供了制備一或多種碳水化合物酯，蛋白質酯，蛋白質亞 基酯或羥基酸酯的方法，所述方法包括將酰基供體，酰基受體與水混合以產生包含 5-98%水的高水分環境，其中所述酰基供體是脂質底物，其選自由磷脂，溶血磷脂 (Iysophospholipid),甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂(Iysoglycolipid)組成的組中 的一或多種，且所述酰基受體是選自由碳水化合物，蛋白質，蛋白質亞基，或羥基酸組 成的組中的一或多種物質；以及將所述混合物與脂質酰基轉移酶接觸，使得所述脂質酰 基轉移酶催化以下反應中的一或所有兩種醇解或酯基轉移作用。本專利技術另一方面提供脂質酰基轉移酶在制備一或多種碳水化合物酯，蛋白質 酯，蛋白質亞基酯或羥基酸酯中的用途，其可通過在酰基供體，酰基受體與水的混合物 中催化醇解和/或酯基轉移作用進行，所述混合物包含5-98%水，其中所述酰基供體是 脂質底物，其選自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂組成的組 中的一或多種，且所述酰基受體是選自由碳水化合物，蛋白質，蛋白質亞基，或羥基酸 組成的組中的一或多種物質。根據本專利技術另一方面，提供了通過本專利技術的方法制備的碳水化合物酯，蛋白質 酯，蛋白質亞基酯或羥基酸酯。根據本專利技術另一方面，提供了通過本專利技術的方法制備的藥物，化妝品，食品， 顏料(paint)，包含碳水化合物酯，蛋白質酯，蛋白質亞基酯或羥基酸酯。根據本專利技術另一方面，提供了本專利技術所述的固定化的脂質酰基轉移酶。本專利技術所涉及內容的小結1.制備一或多種碳水化合物酯，蛋白質酯，蛋白質亞基酯或羥基酸酯的方法， 所述方法包括將酰基供體，酰基受體與水混合以產生含5-98%水的高水分環境，其中所 述酰基供體是脂質底物，其選自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂組成的組中的一或多種，且所述酰基受體是選自由碳水化合物，蛋白質，蛋白質亞 基，或羥基酸組成的組中的一或多種物質；以及將所述混合物與脂質酰基轉移酶接觸， 使得所述脂質酰基轉移酶催化以下反應中的一或所有兩種醇解或酯基轉移作用。2.如1的方法，其中所述脂質酰基轉移酶是固定化的。3.如1或2的方法，其中所述方法包括純化所述碳水化合物酯，蛋白質酯，蛋白質亞基酯，羥基酸酯。4.如1-3中任一項的方法，其中所述脂質酰基轉移酶的特征是，其為具有酰基轉 移酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸殘基中的一或多種L， A, V，I，F, Y, H, Q, Τ, N, M 或 S。5.如前述任意一項所述的方法，其中所述脂質酰基轉移酶包含H-309，或包含組 氨酸殘基，該組氨酸位于與SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水氣單胞菌脂解酶的氨 基酸序列中的His-309相對應的位置。6.如前述所述的方法，其中所述的脂質酰基轉移酶可以從一或多種下列屬的生 物體獲得氣單胞菌、鏈霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝桿菌、鏈球菌、乳桿菌、脫亞硫 酸菌、芽胞桿菌、彎曲桿菌、弧菌科、木桿菌、硫化葉菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏 菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷爾氏菌、黃單胞菌和念珠菌。7.如前述任意一項所述的方法，其中所述脂質酰基轉移酶包含一種或多種以下 氨基酸序列(i) SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ IDNo.3所示氨基酸序列；(iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6所示 氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序列； (viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi本文檔來自技高網...

【技術保護點】
制備蛋白質酯和／或蛋白質亞基酯的方法，所述方法包括將酰基供體、酰基受體與水混合以產生含５－９８％水的高水分環境，其中所述酰基供體是脂質底物，其選自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂組成的組中的一或多種，且所述酰基受體是蛋白質和／或蛋白質亞基；以及將所述混合物與脂質酰基轉移酶接觸，使得所述脂質酰基轉移酶催化以下反應中的一或所有兩種：醇解或酯基轉移作用。

【技術特征摘要】
GB 2003-1-17 0301118.6;GB 2003-1-17 0301121.0;GB 21.制備蛋白質酯和/或蛋白質亞基酯的方法，所述方法包括將酰基供體、酰基受體 與水混合以產生含5-98%水的高水分環境，其中所述酰基供體是脂質底物，其選自由磷 脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂組成的組中的一或多種，且所述 酰基受體是蛋白質和/或蛋白質亞基；以及將所述混合物與脂質酰基轉移酶接觸，使得 所述脂質酰基轉移酶催化以下反應中的一或所有兩種醇解或酯基轉移作用。2.權利要求1的方法，其中所述脂質酰基轉移酶是固定化的。3.權利要求1或2的方法，其中所述方法包括純化所述蛋白質酯和/或蛋白質亞基4.權利要求1-3之一的方法，其中所述脂質酰基轉移酶的特征是，其為具有酰基轉移 酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸殘基中的一或多種L、A、 V、I、F、Y、H、Q、T、N、M 或 S。5.前述權利要求任意一項所述的方法，其中所述脂質酰基轉移酶是在使用“經緩沖 的底物中的轉移酶測定法”檢測時具有至少2%酰基轉移酶活性的脂質酰基轉移酶；所述 轉移酶測定法包括以下步驟i)將450mg磷酸卵磷酯和50mg膽固醇溶于氯仿，在真空條件下蒸發干燥；ii)將300mg膽固醇/磷脂酰膽堿混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml50mM HEPES緩沖液pH 7，并在攪拌過程中使脂質分散到緩沖液中；iii)在使用磁力攪拌器混和的同時，將底物加熱至35°C，并添加0.25ml酶溶液；iv)在反應0、5、10、15、25、40和60分鐘后取出2ml樣品，并立即添加25μ14Μ HCl以酸化游離脂肪酸，終止酶反應；ν)添加3ml氯仿，并劇烈搖晃振搖30秒，將樣品離心，分離2ml氯仿相，并用 0.45 μ m的濾紙過濾，進入IOml涂焦油的Dram玻璃杯中；vi)在60°C氮蒸汽條件下蒸發氯仿，并稱量樣品；vii)通過GLC分析提取的脂質。6.前述權利要求任意一項所述的方法，其中所述脂質酰基轉移酶被分類為 E.C. 2.3.1 .χ ο7.前述權利要求任意一項所述的方法，其中所述脂質酰基轉移酶可以從一或多種 下列屬的生物體獲得氣單胞菌、鏈霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝桿菌、鏈球菌、乳 桿菌、脫亞硫酸菌、芽胞桿菌、彎曲桿菌、弧菌科、木桿菌、硫化葉菌、曲霉、裂殖酵 母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷爾氏菌、黃單胞菌和念珠菌。8.前述權利要求任意一項所述的方法，其中所述脂質酰基轉移酶包含一種或多種以 下氨基酸序列(i) SEQ ID Νο.2所示氨基酸序列；(ii) SEQ ID No.3所示氨基酸序列； (iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6 所示氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序 列；(viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所 示氨基酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序 列，或者與 SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQIDNo.6、 SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQIDNo.26、SEQ IDNo.28、SEQIDNo.30、SEQ ID...

【專利技術屬性】
技術研發人員：阿爾諾D克賴杰，蘇珊M馬德里德，喬恩D米克爾森，喬恩B索伊，
申請(專利權)人：丹尼斯科公司，
類型：發明
國別省市：DK[丹麥]